【Nature Plants】新方法！瑞典农业科学大学实现在植物细胞和亚细胞水平上定量分析mRNA和蛋白质

2023年6月15日，Nature Plants 在线发表了瑞典农业科学大学（SLU）Stefanie Rosa和Adrien Sicard团队题为“Whole-mount smFISH allows combining RNA and protein quantification at cellular and subcellular resolution”的研究论文。该研究提出了一种基于单分子RNA荧光原位杂交的简单方法smFISH，以用于可视化和定量植物整体组织中的mRNA；结合荧光蛋白，smFISH可同时定量单细胞中的mRNA和蛋白质水平，及其亚细胞分布；为在植物细胞和亚细胞水平上同时定量分析mRNA和蛋白质提供了有力的工具。

https://doi.org/10.1038/s41477-023-01442-9

多细胞生物的复杂发育过程，主要通过调控基因的定量时空表达来协调。虽然可利用逆转录或RNA-seq测序方法对基因表达进行精确量化，并依靠细胞特异型分子标记显示特定细胞类型中的基因表达量；然而本质上，这些方法不能提供基因表达相关的细胞环境和细胞间的变异信息。另一方面，尽管RNA原位杂交可用于研究基因表达的空间模式，但它基本上是定性的。因此，在三维分辨率水平上获得mRNA的定量分析，仍具有挑战性；尤其是在具有高水平自发荧光的植物组织中。

单分子RNA荧光原位杂交（smFISH）的发展可解决上述问题，它允许在亚细胞分辨率水平上检测单个转录本并精确量化单个细胞中的mRNA量。该研究也证实，smFISH可通过不同的荧光基团在广泛的植物整体组织中检测mRNA转录本，并具有高特异性和分辨率（Figure 1）。尽管如此，但smFISH仍缺乏对最终基因产物——蛋白质的检测。原则上，通过将mRNA检测与蛋白质免疫荧光相结合可同时获取mRNA和蛋白的信息，但实验流程难度大；将免疫荧光与smFISH相结合的方案，目前仍不能适用于植物。

Figure 1．拟南芥整体组织的smFISH

该研究的策略是将整体组织smFISH（WM-smFISH）与荧光蛋白的检测相结合，比如设计靶向VENUS荧光蛋白mRNA的探针，以同时检测同一转基因表达的蛋白质和转录本。以pDR5rev::3xVENUS-N7和 pCUC2::3xVENUS-N7为例，研究人员验证了上述量化方法的准确性和特异性，并显示该方法能可视化和计算完整植物组织中的mRNA数量；表明这种简单流程是量化整体组织中mRNA水平的有用工具。此外，利用荧光蛋白，该方法还可以同时检测单细胞中的蛋白质数量及其亚细胞分布（Figure 2）。

Figure 2．WM-smFISH可同时定量mRNA和蛋白水平

利用合成的生长素NAA的外源性处理，该研究进一步检测了pDR5rev::3xVENUS-N7植物对NAA的响应。结果显示，WM-smFISH与荧光蛋白成像相结合可以提供有关基因表达的转录-翻译动力学的定量时空信息；这些信息进一步与细胞三维图谱相结合，可作为强有力的工具来评估细胞环境对基因表达和翻译的影响（Figure 3）。

Figure 3．WM-smFISH可在外源刺激下对RNA和蛋白质水平进行空间定量表征

那么，WM-smFISH是否可通过共定位mRNA与荧光蛋白来定量评估mRNA亚细胞定位模式？以核孔蛋白NUP1/NUP2为例，该研究证实WM-smFISH可与不同的荧光报告基因结合使用，以探索mRNA的亚细胞定位或可视化它们与蛋白质伙伴的共定位。此外，该研究还证明WM-smFISH和免疫荧光成像可以按顺序进行，从而允许与内源性蛋白质进行共定位研究；虽然在技术上更具挑战性，但使它能在尚未建立转基因技术的物种中使用（Figure 4）。

Figure 4．WM-smFISH与蛋白质检测相结合可分析亚细胞共定位

总而言之，该研究提出并建立了一个在植物整体组织中进行WM-smFISH的实验方法，能够在多个完整组织中同时量化细胞分辨率水平上的mRNA和蛋白质；为了验证该方法的潜在应用，研究人员证实它可在外源刺激下对RNA和蛋白质水平进行空间定量表征，并用于mRNA的亚细胞定位或可视化它们与蛋白质伙伴的共定位；为在植物细胞和亚细胞水平上同时定量分析mRNA和蛋白质提供了有力的工具。

来源：MP植物科学

转自：“iPlants”微信公众号

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