Nature Genetics | 刘如谦等团队通过碱基编辑进行有效且均匀的胎儿血红蛋白诱导

在红细胞中诱导胎儿血红蛋白(HbF)可减轻β-地中海贫血和镰状细胞病。

2023年7月3日，博德研究所刘如谦、圣犹达儿童研究医院Jonathan Yen及Mitchell Weiss共同通讯在Nature Genetics 在线发表题为“Potent and uniform fetal hemoglobin induction via base editing”的研究论文，该研究表明相比CRISPR-Cas9，碱基编辑能够将胎儿血红蛋白的表达提高到更高、更稳定、更均匀的水平。该研究比较了使用Cas9核酸酶或腺嘌呤碱基编辑器在CD34+造血干细胞和祖细胞中的五种策略。最有效的修饰是γ-珠蛋白-175A >G的腺嘌呤碱基编辑器的产生。

纯合子-175A >G编辑的红系克隆表达HbF(81±7%)，而未编辑的对照组表达HbF(17±11%)，而针对γ-珠蛋白启动子中的BCL11A结合基元或BCL11A红系增强子的两种Cas9策略的HbF水平更低且更可变。在CD34+造血干细胞和祖细胞移植小鼠后产生的红细胞中，-175A >G碱基编辑也比Cas9方法更有效地诱导HbF。该研究介绍了一种有效的、统一的HbF诱导策略，并为γ-珠蛋白基因调控提供了见解。更重要的是，该研究证明了Cas9产生的不同插入缺失可以引起意想不到的表型变异，而这种变异可以通过碱基编辑来规避。

镰状细胞病(SCD)和β-地中海贫血是由HBB基因突变引起的，该基因编码成人血红蛋白(HbA，α2-β2)。这些疾病在出生后出现症状，从胎儿γ-珠蛋白基因(HBG1/ HBG2)表达转换为突变的β-珠蛋白(HBB)。通过对自体造血干细胞(HSCs)进行基因修饰来逆转这种发育开关是一种很有前景的治疗方法。早期临床研究表明，通过Cas9核酸酶介导的破坏红系增强子或RNA干扰来抑制γ-珠蛋白抑制基因BCL11A可诱导胎儿血红蛋白(HbF，α2γ2)，降低SCD或β-地中海贫血的发病率。

γ-珠蛋白表达的治疗性再激活取决于胎儿血红蛋白(HPFH)的遗传持久性，这是一种良性遗传疾病，可缓解共遗传β血红蛋白病的病理。某些形式的HPFH是由单核苷酸变异或小的缺失引起的，这些缺失消除了转录抑制因子BCL11A或ZBTB7A7的γ-珠蛋白启动子结合基序。在造血干细胞和祖细胞(HSPCs)中，基因组编辑核酸酶通过非同源末端连接(NHEJ)破坏这些基序，将HbF表达提高到潜在的治疗水平。其他γ-珠蛋白启动子变体通过为转录激活子创造新的DNA结合基序而引起HPFH 。这些替换不能被核酸酶编辑器轻易地安装，因为NHEJ-HSCs中修复双链DNA断裂(DSBs)的默认途径—会产生不受控制的插入-缺失突变混合物。

碱基编辑器由核酸酶缺陷的Cas9与脱氨酶融合组成，安装精确的碱基对(bp)过渡，并被用于通过破坏γ-珠蛋白启动子中的+58 BCL11A红系增强子或抑制子结合基序来诱导HbF，与Cas9核酸酶类似。此外，碱基编辑器已被用于通过在γ-珠蛋白启动子中创建新的转录因子结合位点来诱导HbF。这些研究结果表明，碱基编辑方法在HbF诱导方面可以优于Cas9诱导的NHEJ策略。这一假设目前正在临床试验中进行验证(NCT05456880)。然而，治疗性HbF诱导的最佳基因组编辑策略尚未确定。

ABE7.10有效诱导HbF（图源自Nature Genetics ）

碱基编辑器与Cas9相比有几个潜在的优势。它们可以在不需要同源性定向修复的情况下有效地产生精确的bp变化，而同源性定向修复在造血干细胞中很难在不产生有害侧支的情况下实现。此外，碱基编辑不依赖于可引起TP53介导的DNA损伤反应和染色体异常的中间DSBs。碱基编辑器可能对修饰重复的、串联排列的γ-珠蛋白基因HBG1和HBG2特别有用，因为Cas9核酸酶在两个位点同时诱导的DSBs可以导致4.9 kb的中间DNA缺失。

为了优化HbF诱导的基因组编辑，该研究使用了与治疗相关的方法来比较五种不同的方法：Cas9破坏+58 BCL11A红系增强子或γ-球蛋白启动子BCL11A结合基序，或在转录起始位点上游-198、-175和-113 bp的三个γ-球蛋白启动子HPFH变体的腺嘌呤碱基编辑器(ABE)安装。与Cas9生成的插入缺失相比，碱基编辑方法更有效，-175A >G通过创建新的TAL1结合基序刺激与基因座控制区(LCR)的远程相互作用(LCR是一种强大的上游增强子)，从而引起HbF的最强诱导。

该研究在小鼠再生的人造血干细胞中获得了临床相关水平的-175A >G编辑，显著减少了缺氧诱导的SCD供体来源的红细胞镰状细胞。碱基编辑产生精确的核苷酸变化，具有均匀的HbF诱导，而Cas9产生的插入缺失混合物即使在具有中断的γ-珠蛋白启动子BCL11A结合基序的细胞中也具有令人惊讶的不同百分比的HbF诱导。因此，碱基编辑代表了一种潜在的、优于Cas9的治疗性诱导HbF的替代方法，部分原因是避免了产生具有不同生物学后果的插入缺失混合物。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41588-023-01434-7

转自：“iNature”微信公众号

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