导读
瓜子金（PJ）已被证明具有多种生物学潜力，如降脂和抗炎作用。然而，PJ对非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的作用和机制尚不清楚。本研究旨在评估PJ对NASH的影响，并阐明其调节肠道微生物群和宿主代谢的机制。我们采用甲硫氨酸和胆碱缺乏（MCD）饮食喂养小鼠诱导NASH模型，并用PJ进行给药处理；首次评估PJ对NASH小鼠的疗效、抗炎和抗氧化作用；然后使用16S rRNA测序对小鼠的肠道微生物群进行分析；最后通过非靶向代谢组学研究PJ对肝脏和粪便中代谢产物的影响。结果表明，PJ可改善NASH小鼠的肝脂肪变性、肝损伤、炎症反应和氧化应激。PJ处理也影响了肠道微生物群的多样性，并改变了NASH小鼠中Faecalibaculum、乳杆菌、Muribaculaceae、Dubosiella、阿克曼菌、Lachnospiracae_NK4A136_group和Turicibacter的丰度。此外，PJ处理调节了肝脏和粪便中的59种代谢产物。根据不同肠道微生物群和代谢产物之间的相关性分析，我们将参与组氨酸和色氨酸代谢途径的代谢物被确定为关键代谢物。本研究证明了PJ对NASH的治疗、抗炎和抗氧化潜力。PJ治疗的机制与改善肠道微生物群失调以及调节组氨酸和色氨酸代谢有关。
论文ID
原名：Aqueous extract of Polygala japonica Houtt. ameliorated nonalcoholic steatohepatitis in mice through restoring the gut microbiota disorders and affecting the metabolites in feces and liver
译名：瓜子金水提物通过恢复肠道菌群紊乱和影响粪便和肝脏代谢物改善小鼠非酒精性脂肪性肝炎
期刊：Phytomedicine
IF：7.9
发表时间：2023.06
通讯作者：温伟波&陈瑶&崔换天
通讯作者单位：云南中医药大学&云南省中医医院&山东大学
实验设计
实验结果
1. PJ改善MCD诱导的NASH小鼠的肝损伤和肝组织脂质沉积
与对照组相比，模型组的小鼠体重显著减轻，肝脏指数较低。PJ和多烯磷脂酰胆碱（PPC）对MCD诱导的NASH小鼠的体重减轻具有改善作用，并显著降低肝脏指数（图1a和b）。HE染色显示NASH小鼠肝细胞中有大量脂肪变性和炎症细胞浸润，PJ和PPC显著改善了肝脏病理（图1c和d）。油红O染色显示，与对照组相比，模型组小鼠的肝组织有显著的脂质沉积，并且在PJ和PPC干预后，NASH小鼠肝脏中的脂质沉积水平降低（图1e和f）。为了评价PJ和PPC治疗NASH的有效性，我们测量了一系列生化参数，包括肝功能标志物总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、丙氨酸转氨酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST）。结果显示，与对照组相比，模型组小鼠的这些标志物水平显著升高。然而，PJ和PPC处理后，病理变化得到了不同程度的缓解，这表明PJ和PPC可能在治疗NASH方面具有治疗潜力（图1g-j）。
图1 PJ对MCD诱导的NASH小鼠有明显的治疗作用
小鼠接受MCD 6周以诱导NASH，并分别口服不同剂量的PJ，对治疗效果进行评价。（a，b）PJ减轻了MCD引起的体重减轻（a）和肝脏指数增加（b）。（c，d）HE染色显示PJ可以改善肝脏的病理变化并降低疾病分数（NAS）；油红O染色（上e）表明PJ可以减少NASH小鼠肝脏中脂质含量的积累（下e）。（f，g）PJ降低了NASH模型小鼠肝组织匀浆中TC（f）和TG（g）的水平。（h，i）PJ改善了NASH小鼠血清中异常的ALT（h）和AST（i）水平。对照组、模型PPC、PJ-l、PJ-M和PJ-H（每组n=10）组。数据以平均值±标准差表示。与对照组相比，##p<0.01和###p<0.001；与模型组相比，*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001。
2. PJ对NASH小鼠炎症和氧化应激的影响
结果显示，与对照组相比，NASH小鼠的超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性降低，丙二醛（MDA）水平升高。相反，PJ和PPC处理导致NASH小鼠的SOD和GSH-Px活性升高，MDA水平降低。（图2a-c）。
此外，MCD诱导的NASH小鼠肝脏中的促炎因子（IL-1β、IL-6和TNF-α）水平高于对照组。相反，PJ和PPC显著降低了NASH小鼠肝脏中IL-1β、IL-6和TNF-α的水平（图2d-f）。
基于上述结果，在接受MCD饮食6周的小鼠中可以诱导经典的NASH。研究还表明，PJ对NASH有良好的治疗作用，并能抑制NASH小鼠的炎症和氧化应激，这在高剂量时最为显著。因此，我们从PJ-H组中选择样本进行后续实验。
图2 PJ治疗对MCD诱导的NASH小鼠表现出显著的抗氧化和抗炎作用
通过检测肝匀浆中的氧化相关因子（SOD、MDA和GSH-Px）和促炎细胞因子（IL-6、IL-1β和TNF-α），评价PJ对NASH小鼠的抗氧化和抗炎作用。（a-c）PJ处理增加了NASH小鼠的SOD（a）和GSH-Px（c）活性，并降低了MDA水平（b）。（d-f）PJ降低了NASH小鼠的IL-6（d）、IL-1β（e）和TNF-α（f）水平。
3. PJ改善MCD诱导的NASH小鼠的生态失调
我们分析测序结果，并使用扩增子序列变异（ASV）策略构建聚类表；使用Shannon和Simpson指数评估肠道微生物群落的α-多样性。结果表明，与对照组相比，模型组的Shannon和Simpson指数较低，这表明NASH降低了小鼠的肠道微生物群多样性（图3a和b），然后，我们进行β-多样性分析，以测量不同样本之间肠道微生物群落的差异。结果显示，模型组与对照组有显著差异，PJ处理组与模型组有显著性差异。主坐标分析（PCoA）图中样本点明显分离，表明NASH导致肠道微生物群多样性的改变，PJ处理产生了积极影响（图3c）。
此外，在门水平上，每组的肠道微生物群以厚壁菌门和拟杆菌门为主。（图3d）。与对照组相比，NASH小鼠的厚壁菌门与拟杆菌门的比率（F/B）更高。PJ处理后，F/B比率显著降低（图3e）。而与对照组相比，Faecalibaculum和Lachnospiraceae_NK4A136_group丰度更高，模型组中的乳酸杆菌、Muribaculaceae、Dubosiella和阿克曼菌减少。与模型组相比，PJ-H组中Dubosiella、阿克曼菌和Turicibacter的相对丰度增加，Faecalibaculum和Lachnospiraceae_NK4A136_group减少（图3f-l）。
基于Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States（PICRUSt），我们分析了改变的肠道微生物群（对照组与模型组以及模型组与PJ-H组）的可能功能。图3j和k显示了具有显著差异（p<0.05）的前10种代谢途径。
图3 PJ改变了MCD诱导的NASH小鼠的肠道微生物群
（a，b）三组的Shannon指数和Simpson指数。（c）三组的PCoA。（d，e）高剂量PJ降低了门水平上的F/B比率。（f-l）高剂量PJ处理导致Faecalibaculum、乳杆菌、Muribaculaceae、Dubosiella、阿克曼菌、Lachnospiraceae_NK4A36_group和Turicibacter在属水平上出现变化。（m，n）肠道微生物群的预测功能途径（m：对照组与模型组；n：模型组与PJ-H组）。共同途径用红色突出显示。对照组、模型组和PJ-H组（每组n=6）。
4. PJ改变MCD诱导的NASH小鼠肝脏和粪便代谢物组成
我们使用非靶向代谢组学对小鼠肝脏和粪便中的代谢物进行分析。主成分分析（PCA）图表明，对照组、模型组和PJ-H组彼此之间有很好的区分（图4a和5a）。我们通过偏最小二乘判别分析（PLS-DA）来衡量该模型的解释力和预测力。在肝脏和粪便代谢产物的评分图中，对照组与模型组比较时Q2Y＞0.9，模型组与PJ-H组比较时，Q2Y＞0.7，从而表明该模型具有更好的解释率（图4b、4d、5b、5d）。拟合和预测曲线显示，所有成对比较的R2均大于0.8，Q2均小于0（图4c、4e、5c、5e），从而证明该模型具有良好的拟合性和良好的预测能力。
我们采用以下三个标准筛选差异代谢产物：（1）变量投影重要性（VIP）>1.0；（2）p＜0.05；（3）倍数变化（FC）>1.2或FC<0.8，我们共筛选出59种共同差异代谢产物（表1）。
表1 PJ处理后肝脏和粪便的代谢物差异
对照组（C）、模型组（M）、PJ-H组（P）（每组n=6）。通路名称。A：丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢；B：氨酰基tRNA生物合成；C：精氨酸和脯氨酸代谢；D：精氨酸生物合成；E：柠檬酸循环（TCA循环）；F：半胱氨酸和蛋氨酸代谢；G：D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢；H：果糖和甘露糖代谢；I：半乳糖代谢；J：谷胱甘肽代谢；K：甘油磷脂代谢；l：甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢；M：糖酵解/糖异生；N：组氨酸代谢；O：亚油酸代谢；P：赖氨酸降解；Q：烟酸和烟酰胺代谢；R：磷酸戊糖途径；；S：苯丙氨酸代谢；T：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成；U：嘧啶代谢；V：核黄素代谢；W：类固醇激素生物合成；X：色氨酸代谢；Y：酪氨酸代谢；Z：维生素B6代谢。与对照组比较，#p＜0.05；##p<0.01。与模型组比较，*p<0.05和**p＜0.01。Δ表示该通路是相应来源中的共同通路。
在下一步中，我们应用了京都基因和基因组百科全书（KEGG）通路分析。结果表明，与对照组相比，模型组发生变化的代谢途径主要由甘油磷脂、色氨酸和半乳糖代谢组成（图4f）。PJ-H处理可显著改变代谢途径，其中最显著的变化是色氨酸、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢以及精氨酸生物合成（图4g）。在粪便中，模型组和对照组之间改变的代谢途径包括精氨酸生物合成、核黄素和维生素B6代谢（图5f）。PJ-H处理后显著改变的代谢途径主要包括色氨酸、组氨酸、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢（图5g）。当比较模型组和对照组以及PJ-H组和模型组在粪便和肝脏中的共同途径时，我们发现丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸、甘油磷脂、组氨酸代谢和色氨酸代谢是共同途径，这些可能是参与NASH的相关代谢产物的途径。
图4 PJ改变了MCD诱导的NASH小鼠肝脏的代谢产物
（a）对照组、模型组和PJ-H组的主成分分析得分图。（b-e）模型组和对照组（b，c）之间以及PJ-H组和模型组（d，e）之间的偏最小二乘判别分析的得分图和置换检验。（f，g）通路分析结果（f：对照组与模型组；g：模型组与PJ-H组）。共同通路用红色标记。*表示与粪便中的共同途径。A至Z代表通路的名称，与表1中的通路一致。对照组（C）、模型组（M）和PJ-H组（P）（每组n=6）。
5. 粪便和肝脏中共同代谢物与肠道菌群的综合分析
当将PICRUSt功能预测的受肠道微生物群影响的途径与粪便和肝脏共同途径相关的代谢物进行匹配时，我们发现组氨酸代谢和色氨酸代谢在微生物群和代谢组中是共同存在的。相关性热图显示，乳杆菌、Muribaculaceae、Dubosiella和阿克曼菌与大多数代谢产物呈显著正相关，而Faecalibaculum和Lachnospiraceae_NK4A136_group显示出相反的效果（图6）。
图5 PJ改变了MCD诱导的NASH小鼠粪便的代谢产物
（a）对照组、模型组和PJ-H组的主成分分析得分图。（b-e）模型组和对照组（b，c）之间以及PJ-H组和模型组（d，e）之间的偏最小二乘判别分析的得分图和排列检验。（f，g）通路分析结果（f：对照组与模型组；g：模型组与PJ-H组）。共同通路用红色标记。*表示与肝脏中的途径相同。A至Z代表通路的名称，与表1中的通路一致。对照组（C）、模型组（m）和PJH组（P）（每组n=6）。
图6 Spearman代谢产物与肠道微生物群变化的相关性分析
Pearson的相关系数由颜色编码量表表示，红色或蓝色越深，该值的绝对值越高。PICRUSt结果和代谢通路之间的共同途径用红色标记。*：p＜0.05，**：p＜0.01。“！”表示该通路是相应来源中的一个共同通路。A至Z代表通路的名称，与表1中的通路一致。
讨论
1. PJ的治疗、抗炎和抗氧化作用
通过喂食MCD饮食建立的NASH小鼠可以复制人类NASH中的脂肪性肝炎，因此已成为NASH的主要模型之一。该模型通过减少甲硫氨酸和胆碱的摄入，重点关注NASH的发展，这反过来又会阻断肝脏极低密度脂蛋白的合成。脂质积聚，最终引发氧化应激和炎症，导致肝损伤。在本研究中，PJ显著降低了血清中肝损伤的指标ALT和AST的水平。此外，肝脏中的TC和TG水平降低。病理组织切片直观地反映了肝脏病变的改善。这些结果与之前的研究结果一致。此外，氧化应激相关标志物和炎症因子水平的测定结果表明，PJ对引起NASH小鼠严重病理变化的这些因子具有很强的治疗作用。同样，这些结果与之前的研究结果一致。总之，这些发现表明PJ对MCD诱导的NASH具有良好而全面的治疗效果。在这项研究中，一种常用于NASH治疗的药物PPC被选为阳性对照进行比较。本研究的数据表明，在减少病理变化和改善肝功能方面，高剂量PJ补充剂的治疗效果与临床使用的NASH治疗药物PPC相当。这表明PJ可以作为PPC治疗NASH的潜在替代品。
图7 本研究的主要发现概述
PJ通过调节肠道微生物群以及与粪便和肝脏中组氨酸和色氨酸代谢相关的代谢产物，改善MCD诱导的小鼠NASH。
2. PJ对肠道菌群的调节作用
研究表明，肠道中乙醇产生菌丰度增加导致NASH患者血液中乙醇水平升高，通过乙醇代谢导致肝脏氧化应激和炎症。常见的益生菌，如乳杆菌、双歧杆菌和链球菌，以及产生短链脂肪酸丁酸的细菌，对NASH发生的不同机制有积极影响。因此，肠道微生物群治疗NASH是一个独特的方向。有人认为，胆固醇抑制疗法和肠道菌群干预可能是预防NAFLD肝细胞癌的有效策略。在这项研究中，PJ处理通过改善α和β的多样性来改变肠道微生物群的结构。
此外，许多研究表明，F/B比率与肥胖和NAFLD之间有很强的相关性。与对照组相比，NASH小鼠具有极高的F/B值，PJ处理后F/B值降低。进一步的分析显示，NASH小鼠的肠道微生物群组成在属水平上发生了显著变化，这可以通过前几种细菌的相对总丰度的变化来表明。Faecalibaculum是一类乳酸产生菌，乳酸被认为具有抗肥胖作用。据推测，这种作用可能与NASH小鼠体重减轻有关。乳酸杆菌属中的几个物种对脂质代谢有改善作用，并且能够纠正微生态失调和修复肠道屏障。一些研究甚至发现，乳酸杆菌发酵食品在改善肠道微生物群、控制体重和修复受损肝脏方面具有相同的能力。Dubosiella的丰度在高脂肪饮食中降低，增加其丰度显著改善脂肪代谢和胰岛素抵抗。阿克曼菌也是一类益生菌，嗜黏蛋白阿克曼菌对胆汁酸代谢和调节血脂水平有积极作用。Lachnospiraceae_NK4A136_group是一种有争议的细菌，一项研究发现利拉鲁肽治疗NAFLD降低了这种细菌的丰度。然而，另一项研究观察到，HFD导致这种细菌的丰度下降，纠正饮食可以恢复控制水平。调节脂质水平或修复肠道屏障的药物也有能力增加这种细菌的相对丰度。Turicibacter的丰度仅在患有严重纤维变性NAFLD的患者中显著增加。然而，在动物实验中，Turicibacter的丰度在HFD诱导的NAFLD中增加，但在MCD诱导的NALD中减少。因此，我们推测Turicibacter在MCD饮食诱导的NAFLD模型中发挥不同的作用。总之，这些结果表明PJ对MCD诱导的NASH小鼠肠道微生物群紊乱具有积极的纠正作用。然而，如前所述，MCD诱导的NAFLD模型显示出一些特异性，这种影响需要进一步的研究才能完全揭示。
3. PJ对粪便和肝脏代谢产物的调节作用
这项研究的最大亮点是结合粪便和肝脏代谢组学，以确定PJ治疗NASH可能影响的代谢途径。结果表明，组氨酸和色氨酸代谢是粪便和肝脏中常见的代谢途径，表明这两种途径可能在PJ治疗NASH中发挥关键作用。
3.1 组氨酸代谢
在组氨酸代谢中，组胺、L-谷氨酸和尿刊酸是筛选后显著的差异代谢产物。组胺通过H1R和H2R中的组胺信号共同调节每个靶器官中的代谢和炎症过程。NAFLD、NASH和终末期肝病患者的血清组胺水平升高。实验研究表明，用组胺治疗小鼠会增加肝脏中库普弗细胞的数量并诱导炎症。在NAFLD的初始阶段，组胺/H2R抑制空肠和肝脏中的胆固醇吸收，从而降低肝脏损伤的严重程度。然而，组胺/H1R信号传导可以促进巨噬细胞的活性，并增加血管重塑中动脉粥样硬化发生的概率。在本研究中，PJ处理后，NASH小鼠体内升高的组胺减少，这表明PJ可能具有调节相关信号的能力，从而通过调节组胺水平来减轻炎症。L-谷氨酸在患有NAFLD和NASH的肥胖和非肥胖患者的血清中都升高，并且与胰岛素抵抗密切相关。甚至已经表明，除胞质支链氨基酸转氨酶1外，所有与谷氨酸代谢相关的肝酶在NASH患者的肝脏中均下调，并与循环谷氨酸水平升高有关。在本研究中，NASH小鼠的谷氨酸积累发生在粪便和肝脏中，表明谷氨酸代谢紊乱。PJ处理后两者的水平均下降，我们推测这种变化与PJ改善谷氨酸代谢有关。尿刊酸是组氨酸到谷氨酸代谢途径中的一种中间体，可促进细胞凋亡。在肝脏中，L-组氨酸的脱氨作用是由组氨酸解氨酶催化的。反式尿刊酸在光化学反应（如紫外光）中变为顺式尿刊酸，并通过细胞内活性氧的产生调节表皮生长因子受体信号传导，随后诱导前列腺素E2的合成和细胞凋亡。最近的一项研究表明，尿刊酸升高与NAFLD患者肠道微生物群的变化高度相关。在这项研究中，PJ处理降低了NASH中尿刊酸升高，这可能与肠道微生物群的调节有关。
3.2 色氨酸代谢
在色氨酸代谢中，我们筛选出L-犬尿氨酸、L-色氨酸、3-羟基邻氨基苯甲酸（HAA）和5-羟基吲哚-3-乙酸（5-HIAA）为差异代谢产物。其中，L-犬氨酸和HAA属于犬氨酸途径，而5-HIAA属于吲哚途径。色氨酸是一种膳食必需氨基酸，通过溶质载体蛋白被肠道上皮细胞吸收。色氨酸被吸收后，可以在细胞内代谢，也可以输送到血液和其他器官进行进一步的代谢和蛋白质合成。绝大多数色氨酸通过犬尿氨酸途径转化（>90%），其次是吲哚途径，只有极少量通过血清素途径代谢。此外，脂多糖和炎性细胞因子都可以激活吲哚胺2，3-双加氧酶1，并通过犬尿氨酸途径促进色氨酸的代谢。因此，色氨酸在NASH小鼠的粪便和肝脏中的积累可能与其代谢受损有关，并且与犬尿氨酸途径破坏相关的可能性更高。阿克曼菌已被证明在炎症模型中调节色氨酸代谢，我们的结果也显示了阿克曼菌和粪便L-色氨酸之间的负相关。L-犬氨酸是犬氨酸途径中的一个关键中心分子。3-HAA是L-犬尿氨酸的下游代谢产物之一，可降低血清和肝脏胆固醇水平。本研究发现PJ可纠正NASH中l-犬尿氨酸升高和3-HAA降低，这可能是PJ调节胆固醇的途径之一。此外，根据相关性分析，乳酸杆菌与粪便3-HAA呈正相关，与粪便L-犬尿氨酸负相关。这与先前的研究一致，即益生菌乳杆菌的处理可以诱导3-HAA的产生。同样，益生菌植物乳杆菌299v已被证明可以降低严重抑郁症患者的L-犬尿氨酸水平。然而，鉴于犬尿氨酸途径在NASH发病机制中的复杂性，还需要更多的研究来揭示其具体作用。5-HIAA是血清素衍生物之一，被认为与不良NAFLD结果和代谢综合征高度相关。然而，本研究得出了不一致的结果，PJ提高了NASH小鼠粪便和肝脏中降低的5-HIAA水平。我们推测，这种增加可能与色氨酸代谢失调的纠正有关。色氨酸代谢途径的失衡导致了具有特定神经活性的代谢产物过多增加，并被认为是各种神经精神障碍（如严重抑郁障碍）的原因。PJ的抗抑郁作用是众所周知的。因此，该结果也为其抗抑郁机制的研究提供了可能的方向。
结论
我们的研究揭示了PJ对NASH的治疗作用。对NASH小鼠肠道微生物群、粪便和肝脏代谢产物的综合分析表明，组氨酸和色氨酸代谢可能是PJ调节肠道微生物群的途径（图7）。
未来，我们计划将多源靶向代谢组学与胃肠道多个位点的菌群标记基因的深度扩增相结合。此外，多时间点的纵向研究设计应该有助于全面了解PJ引起的微生物组成的变化。粪便移植、特异性肠道微生物群移植和缺失模型可用于我们的进一步研究，以深入研究PJ治疗后NASH中不同肠道微生物群和代谢产物之间的关系。
原文链接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0944711323002982
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