病毒感染继续威胁着人类健康。在有效抑制病毒感染的同时避免二次伤害仍然是一个重大挑战。在这里，郑州大学王振亚/史进进和刘军杰合作设计了一种多功能纳米平台(称为ODCM)，由奥司他韦(OP)负载的聚多巴胺(PDA)纳米颗粒被巨噬细胞膜(CM)伪装而成。OP可以通过π-π堆积和氢键相互作用有效地负载到纳米粒子上，载药率高达37.6%。特别是，仿生纳米颗粒可以在病毒感染的受损肺模型中积极积聚。在感染部位，PDA纳米颗粒可以消耗过量的活性氧物种，同时被氧化和降解，实现OP的控制释放。该系统表现出更高的递送效率、炎症风暴抑制和病毒复制抑制。因此，该系统在改善甲型流感病毒感染小鼠模型的肺水肿和保护肺损伤的同时，发挥了显著的治疗效果。该研究以题为“Polydopamine-based nanomedicines for efficient antiviral and secondary injury protection therapy”的论文发表在《Science Advances》上。
在这里，设计了一种多功能纳米平台(称为ODCM)，旨在精确靶向抗病毒和保护肺损伤。受病毒感染后特定生理变化的启发，将巨噬细胞来源的细胞膜(CM)包裹在负载OP的聚多巴胺(PDA)纳米颗粒(NPs)上，以实现感染部位的炎症归巢和多机制联合治疗，构建了ODCM。其中，PDA作为ROS纳米调节剂，是一种天然存在的生物聚合物，具有高度的生物相容性和降解特性，在体内外可以清除多种ROS，抑制ROS诱导的炎症和细胞凋亡。OP用于阻止子代病毒从感染的宿主细胞中释放。很明显，OP可以通过π-π堆积和与PDA NPs的氢键作用有效地负载。由于感染部位的高ROS环境，PDA被ROS氧化和降解，从而实现了OP在宿主细胞中准确和可控的释放。验证了ODCM集成了精确的炎症导向、受控药物释放、清除ROS、抗炎作用、抑制病毒复制和宿主细胞保护。结果表明，ODCM在改善小鼠感染甲型流感病毒(IAV)的症状方面表现出良好的治疗效果，显著减少了感染后的肺水肿和细胞凋亡。ODCM的这种设计为宿主激活的微环境重新编程、IAV复制和各种IAV传播提供了先进、安全和可靠的策略。
图1.ODCM系统形成、病毒抑制和对感染肺损伤的保护示意图
【ODCM的制备与表征】
在碱性条件下与多巴胺以自聚合方式构建PDA纳米粒。由于PDA具有丰富的官能团，它可以通过π-π堆积和氢键作用有效地负载药物。因此，在PDA的磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液中加入OP，搅拌12h，使载药成功。用紫外分光光度计测得OP的载药量为37.6%，包封率为60.3%。此外，为了提高纳米粒的稳定性和靶向性，采用探头超声法从小鼠巨噬细胞系RAW264.7中获得巨噬细胞CM。然后，通过超速离心法、洗涤法和超声法获得CM囊泡。提取的CM囊泡显示出完整的类脂双层结构。接下来，将OP负载的PDA(OD)与CM囊泡共挤出，构建CM包被的OD (ODCM)纳米粒。与RAW264.7相比，CM和ODCM都含有RAW264.7的蛋白质，表明物理挤压后膜蛋白仍然存在。动态光散射分析表明，与未包被的PDA相比，ODCM的流体动力学直径增大了约25 nm，ODCM的zata电位与原始CM囊泡相近，表明PDA的包封成功。
PDA具有较强的清除自由基活性，且呈浓度依赖关系。且CM的包被对PDA的ROS清除性能影响不大。ROS清除引发了PDA的氧化降解，为OP的可控释放提供了机会。
图2.ODCM的表征
【ODCM对A549和MDCK细胞的内化作用】
ODCM调节细胞内ROS和细胞因子IAV感染引起的肺损伤主要涉及两种机制。一种是ROS过量引起的氧化应激损伤，另一种是炎症引起的细胞因子风暴。因此，以IAV感染的MDCK细胞为模型细胞，在体外评价不同处理后细胞内ROS和细胞因子的变化。PDA具有更强的细胞内ROS清除能力。
正如预期的那样，与PBS组相比，OP、PDA、DCM和ODCM处理的MDCK细胞中典型的促炎因子和趋化因子下调，并且ODCM显示出更好的调节效果。病毒感染后炎症介质的释放导致炎症细胞向肺组织迁移，从而导致肺功能恶化。利用ODCM良好的细胞内炎症调节能力，用RAW264.7(经脂多糖处理)和中性粒细胞在体外检测炎症细胞的浸润情况。观察到，与PBS组相比，ODCM处理后的炎性细胞侵袭明显受到抑制。
图3.ODCM调节IAV感染产生的细胞内ROS和细胞因子
【病毒复制抑制与细胞保护】
ODCM对甲型H1N1流感病毒(A/Weiss/43)的抑制作用优于其他两种毒株，且抑制作用呈浓度依赖性。对甲型H1N1流感病毒(A/Weiss/43)的抑制率达90%以上。100μ ODCM对甲型H1N1流感病毒的抑制率达90%以上。
为了评价抗病毒的最佳阶段，分别在病毒感染前(预防效果)、感染期间(竞争效果)和感染后(治疗效果)将ODCM加入MDCK细胞。对流感病毒的预防作用依赖于ODCM的浓度。在最大浓度为100μ时，其预防效果的抑制率约为68%。ODCM对病毒的竞争作用较弱，100 μ时抑制率约为55%，低浓度时对病毒几乎没有抑制作用。这表明ODCM对流感病毒的治疗效果优于前两种给药方法。ODCM在最低浓度时对流感病毒的抑制率达到61%，在最高浓度时达到91%。综上所述，ODCM给药后对流感病毒感染具有最好的抑制作用和最强的治疗作用。且ODCM对宿主细胞具有保护作用。
与不同处理的病毒感染细胞共孵育48h后，病毒感染细胞的mRNA拷贝数明显减少，其中以ODCM的作用最为明显，表明ODCM具有良好的细胞凋亡抑制作用。
图4.ODCM抑制病毒复制并促进宿主细胞存活
【ODCM的体内靶向性研究】
ODCM的长循环和趋炎性是有效治疗病毒感染的主要前提。为研究膜包被ODCM后的免疫逃逸能力，以OD和脂质体为空白对照。ODCM逃避巨噬细胞吞噬的能力明显强于OD和脂质体。
接下来，试图通过不同的动物模型进一步评估ODCM靶向体内病毒感染部位的效果。首先，将斑马鱼与甲型H1N1流感病毒(A/Weiss/43)孵育3小时，构建病毒感染斑马鱼模型。然后，将斑马鱼分别转移到DiI和DiI标记的ODCM溶液中，孵育0.5h。DiI标记的ODCM(红色荧光)在斑马鱼体内显示出较强的荧光信号，表明ODCM可以有效地靶向病变部位。正如预期的那样，病毒感染的病损部位几乎没有游离DiI聚集，这证实了ODCM的靶向能力导致了NPs在病损部位的聚集。
图5.CM介导的免疫逃逸和趋化分布
【ODCM体内治疗作用的研究】
在BALB/c小鼠H1N1感染模型上检测到ODCM的体内治疗作用。与其他处理组相比，ODCM组能明显抑制小鼠的体重下降(P<0.05)。在感染后第6天，PBS组的肺指数和湿/干重比最高，而ODCM治疗组的肺指数和湿/干重比显著低于对照组。与PBS组相比，高剂量ODCM组感染后肺组织中病毒数量明显减少，与M基因表达结果一致。
与PBS组相比，高剂量ODCM组抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平明显增加，表明ODCM处理对宿主细胞的凋亡有较好的抑制作用。由于病毒感染过程中ROS的过量产生，基于PDA强大的抗氧化能力，ODCM具有有效的清除ROS的能力。
图6. ODCM体内治疗效果
【小结】
综上所述，该研究成功地制备了ODCM纳米粒，通过抑制病毒复制、减少氧化应激和调节细胞因子风暴来保护宿主细胞。令人兴奋的是，所制备的纳米药物具有良好的生物相容性和从包被的巨噬细胞膜继承的病变靶向效果。在病毒感染的小鼠模型中，NPs可以在感染部位主动积聚，直接保护宿主细胞，通过抑制病毒复制、清除ROS和减轻细胞因子风暴来减轻病毒感染引起的肺损伤。希望基于仿生CMs的纳米药物在这里的应用能够为病毒感染的多靶点联合治疗提供一种独特的策略，并为感染相关疾病的治疗提供可能性。
原文链接：
https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.adf4098
来源：BioMed科技
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