细胞是生命的基本单位，其中发生着许多精密而神奇的过程。在细胞内，分子马达蛋白（kinesin）扮演着重要的角色，驱动着诸如细胞分裂、信号传导和物质运输等关键生物过程。这些微小而强大的“机器人”类似于我们现实世界中的机械马达，它们能够利用细胞内的分子燃料——三磷酸腺苷（ATP）来产生力量和动能。
科学家们早在1985年就发现了分子马达蛋白，自那时起就一直努力着解密它们的工作原理。这些蛋白质通过在被称为微管的蛋白质高速公路上运载货物，实现细胞内的运输和调节。
图1 微管上被称为肌动蛋白的分子马达的插图
（来自Nature Techonology Feature.2023 ）
在2004年，伊利诺伊大学香槟分校的生物物理与计算生物学中心的Ahmet Yildiz团队研究人员使用一种名为FIONA（一纳米精度荧光成像）的技术，展示了kinesin的行走方式。该文以Kinesin Walks Hand-Over-Hand为题发表于Science杂志。
图2 两种替代性的机制类别解释kinesin的连续运动
（ 来自Science. 2004 Jan 30;303(5658):676-8. ）
然而，由于它们的微小尺寸和快速运动，科学家们长期以来一直面临着挑战，难以直接观察和理解分子马达蛋白的行为。
在超分辨率显微镜技术的发展中，MINFLUX于2016年首次被Stefan Hell团队引入，并将研究成果以“Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes”为名，发布于Science杂志。
相比传统的超分辨率技术，MINFLUX采用了一个类似甜甜圈形状的激光束，将荧光信号局部地置于中心位置附近的零荧光强度点。通过移动这个激光束，研究人员能够准确将荧光分子的位置精确定位到几纳米的范围内对其进行跟踪和定位。
图3 实现2D MINFLUX的设置、测量策略和各种应用领域
（来自Science 355, 606-612,2017）
这种激光形状的选择和精确的信号处理算法是MINFLUX技术的核心。MINFLUX技术能够利用荧光信号的特殊特征，将微小的光信号从背景噪声中分离出来，从而实现了纳米级的空间分辨率。
图4 在活体大肠杆菌细菌中的单分子MINFLUX跟踪
（来自Science 355, 606-612,2017）
最近，科学家们使用MINFLUX技术进行了一系列令人瞩目的实验，实现了对分子马达蛋白在接近生理条件下的跟踪和观察，从而揭示了这些蛋白的关键细节。
由MINFLUX的发明者Stefan Hell领导的研究小组利用MINFLUX的新型仪器设计，在三维空间中跟踪了蛋白的运动。
该研究于2023年3月9日发布于Science杂志，名为MINFLUX dissects the unimpeded walking of kinesin-1。第一作者是Stefan Hell，他同时在哥廷根的马克斯·普朗克多学科科学研究所和海德堡的马克斯·普朗克医学研究所担任职位。
他们的实验结果显示，分子马达蛋白kinesin在接近生理条件下的工作速度约为550纳米/秒，步幅为16纳米。
图5 生理条件下，kinesin质心的亚步伐。
（来自Science379,1004-1010,2023）
图6 kinesin在迈步时的柄旋转
（来自Science379,1004-1010,2023）
此外，通过对蛋白的不同部分进行标记和跟踪，研究人员还揭示了每个步幅包含两个8纳米的亚步，以及蛋白在运动过程中的旋转，导致微小的向右旋转的前进运动。
而在William O. Hancock等人的研究中，他们还发现当kinesin只有一只脚与微管结合时，ATP被吸收，而当两只脚都与微管结合时，ATP被消耗，解决了先前相互矛盾的发现。
图7 kinesin的集体生物化学和机械化学循环
（来自Natl Acad. Sci. USA 112, E7186–E7193,2015）
生物物理学家海德堡的欧洲分子生物学实验室Jonas Ries领导的研究小组使用MINFLUX技术在活细胞中跟踪了kinesin的运动。他们将研究成果以Direct observation of motor protein stepping in living cells using MINFLUX为题发表在Science杂志上。
这篇论文发现由于细胞内的拥挤和不断变化的环境，他们获得的跟踪路径较少，但却成功捕捉到了蛋白的侧向移动、停顿和从一个微管跳跃到另一个微管的行为。这些行为是蛋白为了绕过在纯化样品中通常不会出现的阻碍而采取的努力。
图8 对kinesin进行的3D MINFLUX跟踪（来自Science379,1010-1015,2023）
此外，MINFLUX技术与其他超分辨率技术的结合可能带来更深入的认识。最近，德国普兰克生物化学研究所和德国慕尼黑路德维希·马克西米利安大学物理学院和纳米科学中心合作，引入了分辨率提升的序贯成像技术(RESI)，可以使用不同的标记将相邻的同一目标分子进行标记，使科学家能够区分距离小于1纳米的分子。
该文以“Ångström-resolution fluorescence microscopy”为题于2023年5于24日发表在Nature杂志，第一通讯作者为Ralf Jungmann。
图9 RESI概念图
（来自Nature volume 617, pages711–716,2023）
将MINFLUX的空间定位与RESI技术的标记能力结合起来，可以实现对细胞内分子的更准确定位和互动观察。这种综合应用将为我们提供更详细、全面的细胞结构和动态过程的信息。
这些实验结果极大地推动了我们对分子马达蛋白的认识，揭示了其在细胞内的运动机制和关键细节。通过MINFLUX技术，研究人员能够在接近生理条件下对这些蛋白进行高分辨率的跟踪和观察，为我们深入理解细胞生物学和生命科学提供了全新的视角。
MINFLUX技术作为一种突破性的超分辨率技术，在分子马达蛋白研究中展现了其强大的能力。随着MINFLUX技术的进一步发展和与其他技术的结合，我们有望在细胞和分子层面上揭示更多生物系统的奥秘，推动生命科学研究的进一步前进。
参考文献：
1、https://doi.org/10.1038/d41586-023-01906-0
2、https://www.science.org/doi/10.1126/science.ade2650
3、https://doi.org/10.1038/s41586-023-05925-9
4、https://www.science.org/doi/10.1126/science.abd9944
5、https://www.science.org/doi/10.1126/science.ade2676
6、https://www.science.org/doi/10.1126/science.1093753
来源：BioMed科技
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