突破！研究发现玉米体细胞胚胎再生关键基因—Wox2a，有望打破植物组织培养体细胞再生的基因型限制

以下文章来源于植物生物技术Pbj ，作者W.QQ

植物体细胞去分化、形成体细胞胚和体外再生植株的能力已被用于克隆繁殖和植物基因工程系统的关键组成部分。然而，大多数物种的体细胞胚培养，植株再生受到植物基因型的限制，严重阻碍了基于植物遗传转化的功能基因组学研究和作物改良工作的进展。

近日，美国威斯康星大学农学系Heidi F. Kaeppler团队在国际著名期刊Plant Biotechnology Journal发表了题为“A key to totipotency: Wuschel-like homeobox 2a unlocks embryogenic culture response in maize (Zea mays L.)”的文章。该研究利用一系列玉米品系，我们鉴定Wox2a 基因可诱导体细胞胚胎发生和胚性愈伤组织增殖。

常规玉米转化一直局限于一个狭窄的种质范围，广泛依赖于艰苦的，耗时的，困难的组织培养过程。降低复杂性和增加基因型灵活性的方法有可能对农业和玉米功能基因组学研究和作物改良产生巨大的益处。几十年来，能够形成体细胞胚和胚性愈伤组织的可再生愈伤组织培养已成为玉米转化和克隆植株再生系统的关键组成部分。与其他单子叶植物如水稻、小麦和大麦类似，玉米的可再生培养仅限于少数基因型，这阻碍了基于玉米转化的功能基因组学研究和进展。在这些少数可再生的玉米基因型中，大多数产生一种生长缓慢、紧凑、高度异质的愈伤组织，也被称为 I 型胚性愈伤组织。被鉴定为能够产生 I 型愈伤组织的玉米自交系包括 H99等。与 I 型愈伤组织相比，II 型愈伤组织更适合组织培养和转化应用，因为它易碎，增殖迅速，具有高度胚性和再生性。40多年前，在自交系 A188中首次观察到玉米产生 II 型愈伤组织。尽管一直以来对其他玉米基因型进行了广泛的测试，但没有发现新的玉米 II 型愈伤组织形成系，而且 II 型愈伤组织的高频率产生仅限于A188及其衍生物。

这项研究的目的是使用一种正向遗传学的方法来确定负责玉米3号染色体长臂上的主要组织培养反应QTL的位点。为了鉴定 II 型培养反应的候选基因，研究者从 A188和 B73杂交中产生了一个近交回交系群体。由于 B73在玉米遗传学研究和育种中的重要性、高质量的基因组注释序列的可获得性以及缺乏胚性培养反应，B73被选为玉米轮回亲本。组织培养反应的表型和分子筛选导致鉴定出一个品系，命名为 WCIC1，并且具有高 II 型培养反应，并含有大约98%的 B73基因组含量，在染色体1,3,4和10上具有A188基因组渗入。通过与 B73进一步回交和产生双倍单倍体系，WCIC1的 A188基因组含量进一步降低，这导致鉴定系 WCIC2，其在99.2% 的 B73遗传背景中保留 A188的 II 型胚性愈伤组织应答。如图1 所示，WCIC2在染色体3的长臂上仅保留了两个 A188基因组渗入。对于候选基因座的精细定位，通过与 B73的额外回交进一步降低 A188基因组含量，导致在染色体3上单个 A188序列渗入，约183.3-186.6 Mb。B73注释序列包含该区域内的95个基因模型。根据 A188的 RNA-Seq 分析数据和区域内基因模型的分析，确定了三个主要的候选基因，以进一步检测其对胚性培养反应和植株再生能力的影响。

图1、A188导入可再生近交系 WCIC2的遗传图谱

为了快速筛选候选基因对再生能力的影响，研究者采用了使用组成型启动子驱动候选基因表达的转基因过表达方法。选择了三个候选基因进行进一步的测试，即Wox2a、 Gras23和 Gme1，而且所有这三个基因都在 A188未成熟合子胚胎组织培养的前72小时中表达。在筛选这些候选基因之后，利用玉米中的 F2双亲定位群体进行的遗传定位研究鉴定了几个用于组织培养反应和转化的 QTL，包括染色体3上含有Wox2a的一个 QTL 区域。这些结果进一步表明了 Wox2a 作为候选基因的可能性。

进一步利用转基因过表达方法，研究发现 Wox2a的高水平组成型表达足以诱导B73基因型玉米未成熟合子胚外植体的体细胞胚胎发生。Gras23和Gme1的组成型表达不诱导体细胞胚胎发生。进一步的实验直接比较了 Wox2a-B73和 Wox2a-A188等位基因编码序列的功能，以确定诱导体细胞胚胎的能力是否存在差异。结果显示ZmUbi1: : Wox2a-B73和 ZmUbi1: : Wox2a-A188序列的两种载体均强烈地产生体细胞胚胎，另外研究者没有检测到这两个序列在诱导的体细胞胚胎发生的频率或强度上的显着差异（图2）。

图2、ZmUbi1: : Wox2a-B73二元载体处理 B73幼胚的研究

接下来的研究中，24株再生植株被移植到土壤中并在温室中生长以作进一步分析，其中18株存活下来。试管苗转入温室生长条件后，从叶片组织中分离到基因组 DNA。PCR 用于筛选再生体中报告基因的存在。独立产生的阳性T0植物的数量发生频率为载体FA13的4.5%和FA15的1.6% (图3a)。24株 B73的T0植株中有4株转基因植株检测呈阳性。有趣的是，FA15的单一阳性事件来自一个有三个T0再生体的外植体，而且三个外植体中只有一个是阳性。这些信息，加上在培养中不施加选择压力时再生的大量非转基因“逃逸”植物，表明Wox2a可以以细胞非自主的方式在附近的非转基因细胞中诱导体细胞胚胎发生。所有在温室过渡期存活下来的再生植株均生长成熟并自花授粉产生假定的 T1后代。对两株自花授粉的阳性T0植株产生的T1种子进行了检验发现分离比例与单拷贝半合子亲本一致。

此外，代表独立事件的植物样本产生了 T1种子分离的比例为3:1的表达(图3b，c)。通过PCR 验证了干燥种子的表型(图3d)，结果表明，用ZmUbi1: : Wox2a-A188和 ZmUbi1: : Wox2a-B73载体转化的外植体产生的体细胞胚可再生并产生T0植株。再生植株表型正常，完全可育，从两个阳性植株自花授粉获得 T1种子分析表明T1后代也是表型正常的。

图4、T0再生体和 T1后代的分析

总的来说，研究者描述了一种基于正向遗传学的方法鉴定了一种能够诱导玉米体细胞胚胎发生、胚性愈伤组织形成和植株再生的基因集。在所检测的基因中，研究者鉴定了一个单一的候选基因­­­­：Wuschel-like homeobox protein 2a (Wox2a)，它可以诱导 B73体细胞胚胎形成和脆性、胚性、可再生愈伤组织的生长以及表型正常植株和后代的再生。

原文链接：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/pbi.14098

来源：PBJ

转自：“iPlants”微信公众号

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