导读
五味子作为一种著名的中药和功能性食品，已被证明具有良好的神经保护作用，特别是多糖组分在神经保护中的作用越来越受到关注。本研究的目的是基于血清和尿液中的整体代谢组学方法，研究从五味子多糖（SCP）中分离和纯化的同质多糖SCP2对阿尔茨海默病（AD）大鼠的治疗作用和潜在作用机制。药效学研究结果表明，SCP2显著改善了Aβ25-35诱导的认知功能障碍，改善了氧化损伤，减少了海马中Aβ的沉积。血清和尿液的整体代谢组学结果表明，SCP2干预显著逆转了AD大鼠的代谢谱紊乱。我们共鉴定出40种代谢产物（21种血清代谢产物和19种尿液代谢产物），它们主要参与亚油酸代谢、α-亚麻酸代谢和花生四烯酸代谢。本研究获得的结果将为SCP2治疗AD的机制提供新的见解，并为后续SCP2的结构-活性研究提供基础。
论文ID
原名：An integrated study on the comprehensive mechanism of Schisandra chinensis polysaccharides mitigating Alzheimer’s disease in rats using a UPLC-Q-TOF-MS based serum and urine metabolomics strategy
译名：采用基于UPLC-Q-TOF-MS的血清和尿液代谢组学策略，综合研究五味子多糖减轻大鼠阿尔茨海默病的综合机制
期刊：Food Function
IF：6.317
发表时间：2022.12
通讯作者：刘忠英
通讯作者单位：吉林大学药学院
实验设计
实验结果
1. SCP和SCP2对Aβ25 - 35致AD大鼠学习记忆障碍的影响
为了评估AD大鼠的学习和记忆能力以及SCP和SCP2的潜在治疗效果，我们采用MMW测试。如图1B所示，在位置导航测试的前4天，所有组的逃避潜伏期都随着训练时间的增加而呈下降趋势，但AD组大鼠的逃避潜伏期仍然显著高于其他组。在空间探索试验中（图1C和D），AD组大鼠的交叉次数和目标象限的时间显著低于假手术组（P < 0.01）。其中，SCP H（高剂量SCP处理）和SCP2干预显示出一定的改善（P < 0.05），而SCP L（低剂量SCP处理）对AD大鼠的影响不显著。这些结果表明，SCP H和SCP2可以改善Aβ25-35引起的学习和记忆障碍。
图1 建模、药物处理和行为研究的实验设计（A）；从连续四次每日测试获得的逃避潜伏期（B）；空间探索实验中的目标象限穿越时间（C）；空间探索试验中目标象限AD大鼠的活动时间（D）；各组（E、F和G）的GSH、MDA和SOD水平。数据表示为平均值±SD，**与AD相比，p < 0.01。
2. SCP和SCP2对Aβ25 - 35致AD大鼠血清生化指标的影响
多糖已被证明具有良好的抗氧化活性，而氧化应激在AD的发病机制中也起着重要作用。在本研究中，我们评估了血清超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和丙二醛（MDA）水平。如图1E、F和G所示，与Sham组相比，AD组SOD和GSH-Px水平显著降低（p<0.01），MDA水平显著升高（p < 0.01）。这表明Aβ25-35的注射可能导致AD大鼠的氧化损伤。与AD组相比，SCP2干预后血清GSH-Px和SOD水平显著升高，MDA水平显著降低（p<0.01）。SCP H能显著提高GSH-Px和降低MDA水平，但对SOD水平无显著影响。此外，SCP L组仅在MDA水平上有所改善，但对GSH-Px和SOD水平没有显著影响。上述结果表明，SCP2可能减轻AD大鼠的氧化应激损伤，从而在AD中发挥潜在的神经保护作用。
图2 免疫组化检测海马组织中Aβ的表达
3. SCP和SCP2对Aβ25 - 35致AD大鼠Aβ沉积的影响
Aβ的产生和沉积是影响AD进展的重要因素，可引发神经源性纤维缠结、氧化应激和突触功能障碍。免疫组织化学研究显示（图2），与AD组相比，假手术组的神经元排列紧密，没有显著的Aβ沉积。相反，在AD组中，神经元表现出明显的黄色Aβ沉积的形态学变化。用SCP H和SCP2干预后，Aβ沉积显著减少，而SCP L未能减少Aβ沉积。上述结果表明，SCP2可以抑制Aβ的沉积，从而提高大鼠的认知能力。
图3 来源于负离子模式（A和C）和正离子模式（B和D）中的血清和尿液代谢曲线的PCA评分图。
4. 血清和尿代谢情况
药效学实验结果表明，我们成功建立了AD模型，SCP2和SCP H的干预对AD表现出良好的疗效。为了研究SCP2和SCP在AD治疗中的作用机制，我们对AD大鼠的血清和尿液进行了代谢组学研究。正离子模式和负离子模式下尿液和血清样品的总离子色谱图（TIC）如图S1†所示。在正离子模式和负离子模式下，我们可以在每组中观察到具有相同保留时间化合物的离子强度存在显著差异，表明通过SCP和SCP2的干预，一些内源性代谢物的水平得到了改善。
表1 UPLC-Q-TOF/MS检测血清样本中潜在的生物标志物
潜在生物标志物的水平标有“↓”用于下调和“↑”用于上调。a采用标准品进行鉴定。*p < 0.05，**p < 0.01。
为了获得组间代谢差异的更详细信息，我们进行了进一步的多变量统计分析。我们首先通过PCA分析描述了各组间代谢谱变化的总体视图，图3显示了正离子模式和负离子模式下尿液和血清样本的PCA评分图。得分图显示质控样品紧密聚集，表明整个分析过程中的稳定性可靠。此外，AD组和Sham组之间存在明显的分离趋势，表明两组之间的代谢物存在显著差异。在SCP和SCP2干预后，SCP和SCP2组的结果与Sham组相似，表明SCP和SCP2可改善Aβ25-35诱导的代谢紊乱。
图4 正负离子模式下尿液OPLS-DA评分图及相应的s图
为了进一步揭示各组之间的代谢差异并筛选潜在生物标志物，我们使用正交偏最小二乘法（OPLS-DA）模型和S图分析了尿液和血清数据（图4和图S2†）。如图S2†所示，AD和Sham组以及SCP和SCP2组在血清代谢谱方面显著分离，R2Y和Q2均大于0.9。其中，对于血清样品，AD和Sham组的正离子模式下R2Y = 99%，Q2 = 99%，负离子模式下的R2Y = 99%、Q2 = 97%；对于尿液样本，在正离子模式下R2Y = 99%，Q2 = 98%，在负离子模式下，R2Y = 99%、Q2 = 98%。这表明所建立的OPLS-DA模型具有良好的预测能力。相应S图中的红点表示贡献度更大的化合物。基于这些结果，VIP≥1且p＜0.05的化合物被确定为本研究中的潜在标记物。
表2 UPLC-Q-TOF/MS在尿液样本中检测潜在生物标志物
潜在生物标志物的水平标有“↓”用于下调和“↑”用于上调。a采用标准品进行鉴定。*p < 0.05，**p < 0.01。
5. 潜在生物标志物的鉴定
我们将上述获得的潜在生物标志物信息重新导入Proggenesis QI软件，以便与内部数据库进行初步确认。随后，我们通过将准确的m/z和MS/MS片段与从可用参考标准或在线数据库（HMDB和METLIN）获得的代谢产物信息进行匹配，确定了潜在的生物标志物。以血清中的负离子（tR = 7.82min，m/z = 279.2320）为例，可以说明潜在生物标志物的鉴定过程。我们利用Proggenesis QI软件初步推测m/z 279.2320处的离子为亚油酸（C18H32O2），然后对血清QC样品进行MS/MS分析以确定其结构（图S3†）。我们在7.82分钟观察到279.2320处m/z的提取离子色谱图（EIC），其在MS/MS波谱中产生[m−H]− 279.2320、[m−H−H2O]−261.2213、[m–H−H2O−CO]−233.2235和59.0266（C2H4O2）处的碎片离子m/z（碰撞能量为20 V）。根据其保留时间和碎片信息，我们与参考物质和在线数据库进行比较，最终确定其为亚油酸。最终，21种血清代谢物和19种尿液代谢物被确定为可能的潜在生物标志物，并列于表1和表2中。为了清晰地显示各组之间代谢物变化的趋势，我们使用热图来显示血清和尿液样本之间代谢物的变化（图5A和B）。热图显示AD组和假手术组的代谢产物变化有明显差异。然而，在SCP和SCP2干预后，代谢产物的水平得以恢复。
图5 血清（A）和尿液（B）中不同代谢物的热图
为了研究SCP2和SCP对AD大鼠代谢途径的影响，我们将上述血清和尿液代谢产物引入Metaboanalyst 5.0进行途径分析。SCP和SCP2靶向AD治疗的受干扰代谢途径的潜在生物标志物如图6A所示。本研究选择大于0.2的途径效应值作为潜在的靶途径。因此，亚油酸代谢、α-亚麻酸代谢和花生四烯酸代谢被认为与SCP和SCP2治疗AD密切相关。基于上述结果，我们构建了尿液和血清中不同代谢产物的整体代谢网络图（图6B）。
图6 （A）使用MetaboAnalyst进行血清和尿液的途径富集分析；每个点代表一条通路；颜色越深，点越大，通路越重要。（B）与SCP2和SCP处理相关的AD大鼠代谢途径紊乱的示意图。
讨论
中药五味子被广泛用于治疗包括痴呆在内的神经系统疾病。先前的研究表明，SCP可以有效改善Aβ25-35诱导的学习和记忆障碍。此外，SCP2是一种从SCP中分离纯化的均一多糖，在体外也表现出良好的生物活性。然而，SCP2的体内活性和治疗AD的潜在机制需要进一步研究。在本研究中，基于UPLC-Q-TOF/MS的代谢组学方法用于血清和尿液分析，以研究SCP和SCP2对AD的治疗效果。药效学结果表明，SCP2比SCP具有更好的治疗效果。SCP2显著改善了Aβ25-35诱导的AD大鼠的学习和记忆缺陷。生化分析和免疫组织化学病理学实验结果表明，SCP2减少了Aβ25-35诱导的海马区氧化损伤和Aβ的沉积。研究表明，多糖的生物活性与提取方法、分子量、单糖组成、糖苷键类型和空间结构直接或间接相关。在我们之前的研究中，SCP2的高效凝胶色谱显示，就分子量而言，它是一种均一的多糖，而粗多糖SCP具有广泛的分子量分布，各种多糖的含量变化很大。因此，SCP2比SCP的体内活性更好可能是由于SCP2分子量更均匀，而SCP由于分子量很大可能具有分子间相互作用，从而影响SCP的生物活性。
越来越多的证据表明，氧化应激在AD的发展中起着重要作用。大脑高度缺氧，富含脂质，神经元细胞膜富含不饱和脂肪酸，这些特征使大脑特别容易受到自由基损伤。此外，氧化应激是Aβ诱导神经毒性的重要因素之一。本研究的结果表明，SCP2显著改善了氧化应激损伤并减少了海马中Aβ的沉积，这表明SCP2可能通过抗氧化作用发挥神经保护作用。
代谢组学用于通过分析生物体在特定生理状态下的整体代谢变化来识别可作为疾病诊断和治疗靶点的生物标志物。在本研究中，我们对血清和尿液进行了整体分析，以研究SCP2对AD的治疗效果。结果表明，SCP2给药组对Aβ 25-35诱导的代谢紊乱有显著的纠正作用，显示出回归到假手术组水平的趋势。因此，血清中的21个生物标记物和尿液中的19个生物标记与SCP2和SCP治疗AD相关。然而，不同的生物样品在反映生理状态时具有不同的代谢谱。在本研究中，血清和尿液中的潜在生物标志物显著不同，只有四种相同的代谢产物，包括胆酸、甘油磷胆碱、肾上腺素和脱氢表雄酮。图S4†显示，尿代谢产物主要参与四种代谢途径：α-亚麻酸代谢、生物素代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢和柠檬酸循环（TCA循环），而血清代谢产物主要参与三种代谢途径：亚油酸代谢、花生四烯酸代谢和视黄醇代谢。总之，血清和尿液代谢产物反映了不同的代谢途径。血液在体内循环，涉及许多小分子代谢产物，这些代谢产物主要由外源物质和内源性反应产生。一旦这些物质到达肾脏，水溶性物质以及一些废物被肾脏提取和处理，进而产生尿液排出体外。这也可以解释血清和尿液中代谢物的巨大差异。为了研究血清和尿液代谢物之间的潜在关系，血清和尿液代谢产物之间的Spearman相关性分析如图S5†所示。尿代谢产物如15-脱氧-d-12,14-PGJ2、鹅去氧胆酸和粪卟啉III与血清中的大多数代谢产物表现出强烈的正相关，而苯丙酰基甘氨酸、3,4,5-三甲氧基肉桂酸和生物素与血清中的大多数代谢产物呈显著的负相关。对于相同的代谢产物，血清和尿液中鹅去氧胆酸、胆酸和甘油磷胆碱的水平显示出显著的正相关。很明显，SCP2在AD治疗中的作用机制可能与多种代谢途径有关，这些代谢产物和代谢途径相互关联并相互影响。因此，我们对血清和尿液样本中的差异代谢物进行了整合和分析。结果表明，这些代谢产物主要参与亚油酸代谢、α-亚麻酸代谢和花生四烯酸代谢（图6）。
研究表明，亚油酸代谢紊乱在AD的发展中起着重要作用。增加脑中亚油酸的浓度可能会增加抗氧化、抗炎和抗凋亡作用，从而发挥神经保护作用。此外，据报道，亚油酸可以抑制Aβ42的细胞毒性作用，保护大脑免受神经退行性疾病的影响。在本研究中，与假手术组相比，AD大鼠的亚油酸水平降低，并且在SCP2干预后显著增加，这表明SCP2可能通过增加亚油酸浓度发挥神经保护作用。此外，另一种重要的不饱和脂肪酸二十二碳六烯酸（DHA）已被证明能清除自由基并改善认知缺陷。几十年来，研究人员一直强调DHA在预防潜在的神经退行性疾病治疗中的重要性，大脑DHA水平的不足与帕金森病和阿尔茨海默病等神经退行性病有关。DHA可以通过饮食提供，也可以通过α-亚麻酸（ALA）在体内合成。ALA已被证明能抑制Aβ介导的神经毒性和神经元凋亡，并对AD等神经退行性疾病具有预防或治疗潜力。在本研究中，SCP2显著提高了ALA和DHA的含量，这表明SCP2对AD的治疗作用涉及不饱和脂肪酸的调节。
花生四烯酸（AA）是生物体内分布最广泛的内源性活性物质，在细胞信号传导过程中起着重要作用。在正常剂量下，花生四烯酸可以参与维持身体的自然生理功能，而花生四烯酸也是炎症的重要媒介，可以参与并促成多种炎症疾病。作为亚油酸的重要代谢产物之一，本研究还观察到AA的紊乱。本研究结果显示，AD组亚油酸减少，AA水平升高，这与之前的报告一致。SCP2干预显著提高了AA水平。此外，由于AD组AA的增加，下游代谢产物肾上腺素也显著增加。上述结果表明，SCP2可能通过减轻神经炎症而发挥神经保护作用，从而调节花生四烯酸代谢。
结论
总之，本研究旨在研究SCP2的体内活性，并通过整体代谢组学研究阐明SCP2在AD治疗中的作用机制。药效学实验结果表明，SCP2显著改善了Aβ25-35诱导的AD大鼠学习记忆障碍，改善了氧化应激，并减少了Aβ在AD大鼠海马中的沉积。基于对血清和尿液的整体综合代谢组学研究，SCP2干预显著逆转了AD大鼠的代谢谱紊乱。我们共鉴定出40种代谢产物（21种血清代谢产物和19种尿液代谢产物），它们主要参与亚油酸代谢、α-亚麻酸代谢和花生四烯酸代谢。本研究中获得的数据全面概述了SCP2干预下AD大鼠血清和尿液中的代谢产物，这可能为SCP2治疗AD的潜在机制提供新的见解，并有助于进一步研究SCP2的结构和活性。
原文链接：
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36562313/
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