Nature Communications | Tb-seq系统检测长RNA和RNP的三级结构模块

RNA可以采用复杂的折叠基序和高阶三维结构，这些结构对于各种特定的细胞过程至关重要。许多类型的长碱基RNA转录本包含三级结构区域，这些区域单独或与蛋白质伴侣协同执行生物学功能。然而，当前长RNA结构预测方法无法仅从序列中确定包含稳定RNA三级结构模块或复杂蛋白质结合位点的区域。虽然核磁共振、X 射线晶体学和冷冻电镜等生物物理技术是观察RNA结构的优秀工具，但它们既耗时又难以对包含结构区域和柔性区域混合物的长碱基RNA进行分析，开发用于识别长RNA分子中三级结构区域的工具至关重要。

化学探针是研究RNA结构的有力工具，提高了我们识别RNA中单链和双链核苷酸的能力，目前开发出的检测高阶结构的方法较少。近日，美国耶鲁大学的研究人员在Nature Communications上发表了题为“Systematic detection of tertiary structural modules in large RNAs and RNP interfaces by Tb-seq”的研究论文，他们提供了一种方法来识别长链RNA中结构最紧凑的区域，并与其他远程探测方法一起，选择最佳区域进行高分辨率研究，Tb-seq检测在RNA三级结构和 RNP复合物中中发现的尖锐骨架转折，提供了一种扫描转录组以寻找稳定结构模块和潜在核糖调节基序的方法。

研究人员为以高通量方式精确识别三级RNA结构，采用建立的Tb3+ RNA裂解实验来精确检测RNA中单核苷酸。为了使这一方法适应测序读数，首先确定了预期的Tb3+裂解位点是否可以在逆转录酶的逆转录过程中作为终止事件被检测，研究人员利用来酵母II族内含子aI5γ的D135核酶，发现逆转录停止重现了Tb3+裂解模式，验证了RT作为检测Tb3+诱导裂解的工具。此后将该方法用于NGS测序。利用开发的管道，评估RT终止事件的流程，以量化终止。Tb-seq这种测序和分析方法概括了D135 Tb3+切割位点。

为了对Tb3+裂解法分析的RNA进行Tb-seq基准测试，研究人员对含有折叠良好的RNA三级元件和已知金属位点的体外转录RNA的伊平屋桥大洋芽孢杆菌的II组内含子进行了检测。他们发现探测前内含子变性切割信号会消失，支持了裂解信号是RNA结构的指标，并且二级结构不足以建立信号，说明了Tb-seq信号对应于三级结构位点。这些结果表明Tb3+配位和位点特异性RNA的切割需要正确折叠的内含子以及定义明确的三级元件。

此后研究人员建立了一套三点标准，用于选择可能由特定位点结合的Tb3+依赖性切割产生的核苷酸终止位点。观察到最强的Tb3+位点位于RNA二级结构内的短环区域。该区域在进化上最保守的长RNA三级相互作用内或与之相邻，这些相互作用对于正确折叠核酶至关重要。Tb3+信号在大洋芽孢杆菌晶体结构上可视化后，研究人员发现Tb3+在正确折叠活性核酶所需的 RNA 三级基序的组成部分引起断裂。结果表明Tb3+可以检测到II组内含子中功能重要的相互作用。

进一步测试Tb-seq，研究人员对已明确三级结构的丙型肝炎病毒内部核糖体进入位点进行检测，发现Tb3+信号聚类的两个区域与病毒蛋白翻译有关，表明铽探测可以检测 RNA 中功能重要的结构，使其可以用作筛选工具来识别可能包含紧凑基序的区域。

为探究Tb-seq对细胞环境中RNA-蛋白的作用，研究人员开发出保持完整RNA-蛋白质复合物裂解哺乳动物细胞的方法，探测人类RNaseP。将Tb-seq信号与RNase P H1 RNA的冷冻电镜结构进行比较，他们观察到Tb-seq 信号对应于 RNA 的暴露区域，这些区域形成结构基序，通过 RNase P内的蛋白质相互作用稳定。使用Tb3+在没有蛋白质的情况下探测人类 RNase P，进行差异反应性比较发现，ΔTb 检测到RNase P 中蛋白质稳定的 RNA 结构模块。

研究人员为应用Tb-seq于长病毒RNA基因组，对SARS-CoV-2 感染的细胞中细胞裂解物进行Tb-seq，发现大部分Tb-seq 信号位于小的茎环或凸起区域，表明这些区域是紧凑RNA结构的模块，ΔTb显示出RNA三级结构在没有蛋白质情况下的构象变化和蛋白质成分稳定的骨架弯曲模块，这些数据共同强调了Tb-seq在缩小结构模块范围和提供病毒基因组内候选功能元件的粗粒度路线图方面的实用性。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-023-38623-1

转自：“植物生物技术Pbj”微信公众号

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