英文原题：A Cell-Free Gene Expression Platform for Discovering and Characterizing Stop Codon Suppressing tRNAs
供稿人：张贤睿 北京大学
大家好，今天为大家介绍一篇ACS Chemical Biology文章，标题为“A Cell-Free Gene Expression Platform for Discovering and Characterizing Stop Codon Suppressing tRNAs”，文章的通讯作者是来自美国西北大学的Michael C. Jewett教授。在这项研究中，作者研究团队开发了一种以大肠杆菌粗提物为基础的细胞外基因表达系统，用以快速表达和表征功能性阻抑tRNA（suppressor tRNA）。他们的方法通过内源机制与含有终止密码子的超级折叠绿色荧光蛋白（sfGFP）报告基因同时共表达正交的tRNA，其中的sfGFP可作为简单的抑制活性读出。作为模型，他们评估了几种正交tRNA的UAG和UAA抑制活性，证明了两个相互正交tRNA的共转录可以在单个sfGFP中插入两个不同的非天然氨基酸（ncAA）。最后，他们展示了这种细胞外工作流程可用于发现宏基因组数据中可能的UAG阻抑tRNA，这些tRNA被内源性氨酰-tRNA合成酶非特异性地识别。作者研究团队预计，这种细胞外系统将加速合成生物学中正交翻译系统的开发。（图1）。
图1. 细胞外基因表达系统示意图
非天然氨基酸（non-canonical amino acids, ncAAs）在蛋白质工程方面具有广泛的应用潜力，通过在蛋白质的特定位点插入ncAAs，研究者们可以调节酶催化、抗体结合、生物材料性质和治疗性肽活性等特性。然而ncAAs的定点插入技术面临的一个核心问题就是发现和表征适用的正交转运RNA（tRNA）和氨酰-tRNA合成酶（aaRS）。这些正交的aaRS-tRNA对必须满足严格的要求，包括独立于内源tRNA和aaRS，但又能够同辅助翻译因子、延伸因子和核糖体所兼容。此外，它们还应具备足够的氨酰化活性以支持蛋白质合成。最近的研究发现了几对满足这些条件的正交aaRS-tRNA对，包括工程化的M. j. TyrRS-tRNATyrCUA和吡咯赖氨酸（Pyl）PylRS-tRNAPylCUA。同时辅以目前飞速发展的定向进化策略也使得发现更有效的aaRS-tRNA对成为可能。然而，在活细胞/细菌中繁琐和耗时的工作流程通常阻碍了对正交翻译系统（orthogonal translation systems, OTSs）所需组分的发现和表征。
无细胞蛋白质合成（Cell-free protein synthesis, CFPS）系统已成为生物工程的强大方法。它们已被用于快速迭代糖基化途径、代谢途径和治疗性蛋白质的设计，并对新的正交翻译系统（OTS）组分的发现和表征起到了促进作用。事实上，CFPS已被用于高效合成含有单个非常规氨基酸的多个蛋白质，其中一些具有毒性、无法穿透细胞膜、不溶性或含有非L-α氨基酸骨架。它还可以将多个不同的非常规氨基酸合并到单个蛋白质中，重新分配密码子，并筛选一系列经过工程改造的aaRS变体库。这些进展都得益于其快速（<8小时）和高产（>克/升）的蛋白质合成以及绕过细胞生存能力限制的能力。
在这篇文章中，作者提出了一种模块化和高效的无细胞方法，可以快速表达和评估终止密码子的阻抑tRNA。首先，他们设计和优化了内源系统的构建，使得tRNA能够与mRNA模板在原始提取物中共同转录并表达含有ncAA的蛋白质（图2）。该tRNA构建包含了一个位于质粒模板上的proKE. coli启动子和终止子，用以促进tRNA的表达和成熟。接下来，他们展示了这种方法可推广用于表达和评估一组常用的UAG和UAA阻抑tRNA，他们利用这些互相正交的tRNA通过原位转录两个不同的tRNA将多个不同的ncAAs插入到单个蛋白质中。最后，他们使用这个工作流程筛选和表征一组潜在的UAG阻抑tRNA，并表明它们是功能性的UAG抑制剂，同时是大肠杆菌谷氨酰-tRNA合成酶（GlnRS）的底物。
图2. 细胞基因表达平台用于在CFPS中发现和表征tRNA
作者首先从一种基于粗提取物的CFPS反应中表达tRNA的通用方法出发。为了进行基准测试，首先评估了在CFPS中是否可以使用转酶（transzyme，一种作者使用T7 RNA聚合酶的构建体，用以提高CFPS反应的产量）来转录正交tRNA。这个“转酶”模板包含一个缓冲区序列、一个T7启动子、用于转录不利于5'序列的锤头状核糖酶，以及一个3'端终止DNA模板的tRNA序列。他们通过将M. j. tRNATyrCUA、M. b. tRNAPylCUA、M. a. tRNAPylCUA和一个工程化的A17 VC10 InttRNAPylCUA的线性DNA模板以30 ng/μL的浓度加入CFPS反应中进行评估，发现所有的转酶都支持216UAG-sfGFP的表达。有趣的是，使用M. j. tRNATyrCUA模板表达216UAG-sfGFP不需要GamS (用以启动线性DNA模板的表达)，而使用M. a. tRNAPylCUA的产量降低。
表1. 本工作中使用到的正交翻译系统以及ncAAs
为了测试tRNA的共转录表达和加工，他们首先在一个质粒上克隆了M. j. tRNATyrCUA，在其上使用proK启动子和终止子进行标记。结果显示，当M. j. tRNATyrCUA和216UAG-sfGFP质粒同时存在时，216UAG-sfGFP的产量高达约725 μg/mL，表明利用内源机制表达的tRNA与锤头核糖酶构建对于琥珀抑制作用同样高效（图3a）。同时仅添加216UAG-sfGFP质粒会导致显著的终止密码子的非特异性抑制（图3a）。电喷雾离子化质谱（ESI-MS）对完整蛋白质的分析表明，这种终止密码子的非特异性抑制主要是由谷氨酰和酪氨酸的非特异性插入引起的，这些情况在先前观察中已经出现（图3b）。作者还发现，在线性模板中进行proK驱动的表达是不起作用的，这可能是由于这些载体需要超螺旋结构才能激活转录。这使得无法直接将其与线性转酶构建进行比较。尽管如此，这些结果表明，在细胞外蛋白质合成系统中，利用内源机制对tRNAsCUA进行转录和成熟可实现琥珀抑制（amber suppression）。接下来，为了减少终止密码子的非特异性抑制并优化216UAG-sfGFP的表达，作者对反应温度进行了优化，他们发现终止密码子的非特异性抑制和温度呈反比关系，并且在较高温度下，216UAG-sfGFP的产量在没有tRNATyrCUA DNA的情况下与有其存在时的产量之比最小（图3c）。将反应温度设置为约37°C而不是30°C可以在保持低终止密码子的非特异性抑制的同时平衡蛋白质产量。为了弥补在37°C下产量的损失，他们优化了216UAG-sfGFP和tRNATyrCUA质粒的比例，以减少不利的竞争（图3d）。高浓度的proK驱动的tRNA模板（约20 ng/μL）和低浓度的T7驱动的216UAG-sfGFP模板（约5 ng/μL）可以产生最高的蛋白质产量。同时通过ESI-MS结果也显示出与ncAA插入216UAG-sfGFP中一致的质量变化（图3e）。这表明可以优化CFPS反应，实现相对高产的ncAA插入。
图3. 基于proK构造的正交tRNA表达功能性验证以及ncAAs插入优化
在优化了tRNA共表达和ncAA插入系统后，作者评估了一组常用的其他正交UAG和UAA阻抑tRNA。为了实现这一目标，他们将一组正交的tRNAPyl（表1）克隆到proK载体中，并将这些质粒加入CFPS反应中，发现每个tRNATyrCUA的216UAG-sfGFP产量都相对稳定（图4a）。ESI-MS结果也表证了AzK的插入，表明tRNAPylCUA的表达和琥珀抑制效率较高（图4b）。同时，在实验中作者还观察到不同的UAA阻抑tRNA表现出不同的活性（图4c）。使用M. j. 和M. a. tRNAsUUA时，216UAA-sfGFP的产量相对较高，约为216UAG-sfGFP产量的75%至80%。然而，使用M. b. tRNAPylUUA时，216UAA-sfGFP的产量只有216UAG-sfGFP产量的25%，而使用A17 VC10 InttRNAPylCUA时几乎没有产量。作者推断很可能是由于RF2在UAA处终止。通过对纯化蛋白质进行ESI-MS分析，作者确认了M. jannaschii、M. barkeri和M. alvus tRNAsUAA在UAA处的ncAA插入（图4d）。这些数据表明，他们在粗提取物中使用原生tRNA加工的方法可以推广到其他tRNATyrCUA，并且可以鉴定功能性tRNA。
图4. 多种UAG和UAA正交阻抑tRNA可以在CFPS期间原位表达。
有了几种UAG和UAA阻抑tRNA后，作者下一步致力于实现在一个蛋白质中使用两个不同密码子实现多个不同的ncAAs插入。在这个实验中，两个相互正交的tRNA将同时表达，用于抑制UAG和UAA密码子（图5a）。作者选择了相互正交的M. j. tRNATyrCUA和M. a. tRNAPylCUA两个tRNA，将216UAG-212UAA-sfGFP作为报告基因，实验结果以及质谱数据证明了只有当两个tRNA模板同时存在时才能合成（图5b，c）。因此，同时转录两个相互正交的tRNA可以在一个蛋白质中指导两个不同的ncAA插入。
图5. 在单个蛋白质中插入两个不同的ncAAs
之后，作者试图将他们的tRNA表达平台应用于发现和表征潜在的UAG阻抑tRNA。在他们的方法中，只有当内源的大肠杆菌aaRS识别到UAG阻抑tRNA时，才会表达216UAG-sfGFP报告基因（图6a）。他们筛选了一组包含六种潜在的UAG阻抑tRNA，这些tRNA被发现存在于使用替代遗传密码的噬菌体基因组中。他们通过在反应中加入从体外转录反应中纯化的tRNA来确认这些tRNA在CFPS中的功能（图6b）。结果表明，所有六种tRNA都支持216UAG-sfGFP的合成，说明它们是功能性的琥珀抑制剂。但是其中两种（A6_CU-CL_34-1和H18 Tanzania_33-33）产量较低。他们将这些序列克隆到proK表达载体中，以测试细胞外反应是否能够表达这些tRNA。实验结果表明所有tRNA均表达216UAG-sfGFP（图6c）。同时还捕获到了功能上的定性趋势，例如A6_CU-CL_34-1对216UAG-sfGFP的较低表达。这些结果表明该平台可以表达在宏基因组数据中鉴定的UAG阻抑tRNA并评估其功能。最后，作者通过质谱结果鉴定到这些tRNA被内源的大肠杆菌GlnRS非特异性识别（图6d）。为了进一步确认这些tRNA是GlnRS的底物，他们还进行了一种通过LC-MS检测酰化腺苷的氨酰化测定的实验。在这个实验中，包含GlnRS、谷氨酰胺和大肠杆菌总tRNA混合物的反应产生了与gln-A完全相同质量（m = 396.1626 Da）的产物（图6e）。类似地，使用六种潜在的UAG抑制剂作为GlnRS底物时，观察到具有相同质量和保留时间的产物（图6e）。这些数据与大肠杆菌GlnRS通过谷氨酰胺对UAG抑制剂进行非特异性氨酰化的结果一致。
图6. Putative UAG suppressing tRNAs can be expressed and characterized for activity with E. coli aaRSs
最后对这个工作做一个总结：该工作开发了一个细胞外平台，用于表达和评估阻抑tRNA。该方法利用内源性大肠杆菌机制，同时共转录tRNA和目标蛋白质mRNA以插入非天然氨基酸（ncAA）。该工作通过展示利用CFPS中的内源性tRNA加工序列可以表达各种正交的tRNA，进一步拓展了该项技术。UAG和UAA阻抑tRNA单独或是同时存在都与该系统兼容。最后，他们使用这项技术对tRNA进行表征，并确认了六个潜在的UAG阻抑tRNA活性。这些UAG阻抑tRNA与谷氨酰胺非特异性氨酰化，以支持琥珀抑制。
转自：“ACS美国化学会”微信公众号
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