Nature | 诺奖得主新作！揭秘CRISPR系统进行基因组扩增的全新机制

CRISPR-Cas适应性免疫系统从入侵的可移动遗传元件中捕获DNA片段，并将其整合到宿主基因组中，为RNA引导免疫提供模板。CRISPR系统通过区分自身和非自身来维持基因组完整性并避免自身免疫，这一过程中CRISPR/ Cas1-Cas2整合酶是必要的，但不是充分的。

2023年6月14日，加州大学伯克利分校Jennifer A. Doudna团队在Nature 在线发表题为“Genome expansion by a CRISPR trimmer-integrase”的研究论文，该研究展示了I-E型系统中的一种优雅的替代途径，它使用内部的DnaQ样外切酶(DEDDh)来选择和加工DNA，并使用原间隔相邻近基序(PAM)进行整合。

原核生物使用CRISPR-Cas适应性免疫系统来创建感染的序列遗传记录。CRISPR序列阵列由短重复序列和大约30 bp的外源DNA衍生间隔序列组成，转录和加工产生成熟的CRISPR RNAs (crRNAs)，引导匹配遗传物质的干扰，保护宿主免受记录序列的伤害。Cas1-Cas2整合酶通过选择和插入新的间隔片段来驱动CRISPR阵列的进化。Cas14-Cas22是一种异六聚体复合物，可特异性识别含有约30 bp短单链3 '悬空片段的DNA片段(原间隔物)。PAM在DNA捕获期间被选中，但在宿主基因组整合之前被移除。协同选择和去除PAM确保Cas干扰模块针对真正的侵入元件，而不是宿主CRISPR阵列。

PAM选择和去除的多种机制强调了在CRISPR序列获取过程中，PAM在维持适应性免疫和基因组完整性方面的重要性。在包括II-B型、部分V型和I-A、I-B、I-C、I-D和I-G型在内的CRISPR系统中，Cas4内切酶执行PAM选择和加工。然而，大约40%的CRISPR亚型缺乏Cas4。在缺乏Cas4的系统中，如常见实验室大肠杆菌K12菌株的I-E型系统，Cas1含有PAM结合口袋，据信参与原间隔序列前体(prespacer)选择。然而，Cas1是否以与Cas4相似的方式切割PAM，还是依赖宿主核酸酶来完成这一功能尚不清楚。

最近的体外研究发现宿主外切酶在原间隔序列前体底物修饰中有能力帮助Cas1-Cas2修饰。独立的外切酶，如类似DNA的外切酶类DEDDh，是广泛存在于每种CRISPR-Cas类型中的辅助成分。还有I-E型系统含有天然的Cas2/DEDDh外切酶融合，进一步表明外切酶与CRISPR整合酶之间存在功能联系。这些系统为研究宿主外切酶和CRISPR整合酶之间的协调提供了一个模型。

Cas1-Cas2 /DEDDh将原间隔序列前体加工成正确的尺寸以进行整合并保护TT PAM（图源自Nature ）

该研究通过天然存在的Megasphaera NM10相关的Cas2和DEDDh融合蛋白(Cas2/DEDDh)与Cas1复合物(Cas1 - Cas2/DEDDh)重建CRISPR序列捕获、加工和整合。作者发现Cas1-Cas2 /DEDDh在原间隔序列前体处理和整合的第一步中保留了PAM。在完成完全集成之前，将删除PAM。DEDDh活性位点，而不是Cas123，负责最初的3 '悬垂修剪和PAM去除。这一机制与Cas4不同，Cas4以核内裂解方式切割PAM，表明宿主外切酶在PAM加工中的作用不同。

天然的Cas1-Cas2 /外切酶融合(修饰整合酶)催化协调的DNA捕获、修剪和整合。在DNA整合之前和过程中，CRISPR修饰整合酶的五种电镜结构显示了不对称处理如何产生大小定义的含PAM的底物。在基因组整合之前，PAM序列由Cas1释放并被外切酶切割，将插入的DNA标记为自我，防止CRISPR异常靶向宿主。总之，这些数据支持一个模型，即缺乏Cas4的CRISPR系统使用融合或募集的外切酶来获得新的CRISPR免疫序列。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41586-023-06178-2

转自：“iNature”微信公众号

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