JHM：一种SERS读取，CRISPR/Cas驱动的传感策略对食品和环境中SARS-CoV-2进行无扩增及抗干扰检测

以下文章来源于食品放大镜 ，作者马龙团队

近期，天津科技大学马龙教授课题组报道了一种SERS读取，CRISPR/Cas驱动的生物传感策略，将其命名为OVER-SARS-CoV-2 (One-Vessel Enhanced RNA test on SARS-CoV-2)。研究人员通过定制一个巧妙的容器，将内外管结合形成独立的反应器。RNA反转录、Cas12a反式切割和SERS纳米探针交联三个步骤可以整合到一个独立的反应器中，无需开盖即可完成核酸检测。该方法实现了对模拟的冷链食品及环境样品中的SARS-CoV-2进行无扩增与抗干扰检测，且成功用于临床咽拭子样本检测。相关成果以“A SERS-signalled, CRISPR/Cas-powered bioassay for amplification-free and anti-interference detection of SARS-CoV-2 in foods and environmental samples using a single tube-in-tube vessel”为题发表于国际权威杂志Journal of Hazardous Materials, 2023, 443, 130234 (IF=14.224)。

背景介绍

SARS-CoV-2感染能够引起新型冠状病毒肺炎(COVID-19)，在相当长的时间内造成持续的全球大流行，曾蔓延至200多个国家，对国际公共卫生造成严重威胁，扰乱全球经济，影响人类身心健康。因此迫切需要开发快速、灵敏、便携的检测方法。

核酸检测因其高灵敏度、高特异性在多种病原微生物检测中被认为是金标准。与目前的实时荧光定量PCR(qPCR) 不同，CRISPR/Cas系统被誉为下一代诊断技术。CRISPR/Cas12a在crRNA的引导下特异性识别并结合特定靶序列 (dsDNA或ssDNA) 后，Cas12a效应子呈现强大的反式切割活性，导致周围单链DNA (ssDNA)的非特异性的切割。近年来，各种基于CRISPR/Cas的诊断 (CRISPR-Dx) 策略被逐渐开发。CRISPR-Dx具有快速、简单、高灵敏度和高特异性等优点，可与荧光、比色、试纸条等不同输出信号结合应用于SARS-CoV-2检测。然而，这些基于CRISPR的检测方法大多依赖于目标序列的前置扩增。而前置扩增通常使用多种酶、定制引物或昂贵的仪器；此外，前置扩增可能导致扩增偏倚，增加了检测的复杂性或在分析核酸原拷贝时导致非线性畸变。因此，无前置预扩增(Amplification-free) 的检测具有一定优势，值得对其进行科学研究与技术开发。

研究的主要内容

在这项研究中，作者建立了一种由SERS读取、CRISPR/Cas驱动的纳米生物传感策略，并将其命名为OVER-SARS-CoV-2 (One-Vessel EnhancedRNA test on SARS-CoV-2)，通过设计、定制一个巧妙的单管容器，将内外管结合形成独立的反应器。RNA反转录、Cas12a反式切割和SERS纳米探针交联的步骤可以整合到一个独立的反应器(一锅) 中，无需开盖即可完成核酸检测。其可以在单管中超灵敏、准确、便携的检测SARS-CoV-2，无需事先进行核酸扩增。具体为，基于纳米金与巯基的相互作用，实验人员构建了SERS纳米探针 (AuNP@4-MBA@ssDNA)，利用CRISPR/Cas12a特异识别和结合目标核酸序列后的非特异核酸切割活性，对Linker ssDNA (连接DNA) 进行反式切割进而调节SERS纳米探针的分散与聚集变化，随后可通过离心或简单过滤得到分散的纳米探针，并测定SERS信号。在这种情况下，核酸信号可以被灵活的转换和放大为SERS信号。该研究结果表明，在不进行预扩增的情况下，此方法可检测低至200 copies/mL的SARS-CoV-2样品；能够在45分钟内实现2×102至1×108 copies/mL的SARS-CoV-2定量检测。此外，通过检测临床拭子样本，该方法已被证实与qPCR方法具有一致性；此外该方法被成功用于模拟复杂环境与食品样品中SARS-CoV-2的检测。

图1所示为OVER-SARS-CoV-2检测原理图。a：用于无扩增检测SARS-CoV-2的纳米生物传感策略。b：设计的新型套管装置(左) 和单管一锅法检测SARS-CoV-2 RNA的原理图 (右)。c：纳米生物传感策略每个步骤所需的估计时间。

如图2所示，SERS纳米探针的表征及方法可行性验证。a：不同粒径的AuNPs在波数为1075 cm-1时，对阳性和阴性样本的拉曼信号响应直方图。b：EDX-TEM 图像。c与d：拉曼光谱和再波数为1075 cm-1的拉曼信号直方图。e与f：不同样品的紫外-可见吸收光谱图。g：动态光散射结果。h：TEM图像。i：不同浓度的Linker ssDNA与AuNP@4-MBA@ssDNA纳米探针孵育，离心前后颜色

对比。j：图i中离心样品上清液在波数为1075 cm-1处的拉曼信号强度直方图。k：方法可行性评估。l：图k中样品在波数为1075 cm-1时拉曼信号强度直方图。

图3为纳米生物传感策略检测SARS-CoV-2假病毒的性能验证。a：紫外-可见吸收光谱测定。b：不同浓度的SARS-CoV-2假病毒在离心前 (上) 和离心后(下) 或过滤后 (右) 的溶液颜色变化。c与d：离心后检测不同浓度SARS-CoV-2假病毒的拉曼光谱及波数为1075cm-1拉曼信号直方图。e：拉曼信号强度与SARS-CoV-2假病毒浓度之间的线性关系 (离心法)。f与g：过滤后检测不同浓度SARS-CoV-2假病毒的拉曼光谱及波数为1075cm-1拉曼信号直方图。h：拉曼强度与SARS-CoV-2假病毒浓度之间的线性关系 (过滤法)。i与j：特异性研究。k与l：基于离心法和过滤法的纳米生物传感策略的重复性和重现性。m：热图显示33个SARS-CoV-2假病毒样本检测结果并与qPCR进行比较。“+”和“-”分别表示qPCR阳性和阴性样品。n：不同课题组报道的无前置预扩增的CRISPR/Cas检测法检测限 (LoD) 的比较。

如图4所示，作者提出的纳米生物传感策略在检测SARS-CoV-2临床样品中的应用。a：所提出的纳米生物传感策略检测临床样品的工作流程示意图。b：所提出的纳米生物传感策略和RT-qPCR (按Ct值排序) 检测50个COVID-19阳性临床样品的结果。c与d：与RT-qPCR相比，所有临床样品 (50个COVID-19阳性样品和50个阴性样品) 的检测结果总结。e：针对100个临床样品检测，所提出的纳米生物传感策略与RT-qPCR之间的一致性表。用于检测SARS-CoV-2 N基因的灵敏度值 (%) 以红色显示；特异性值 (%) 以黑色显示。f至h：用于检测临床样品检测时，RT-qPCR得到的Ct值与拉曼强度之间的相关性。

小结

在本研究中，我们首次设计了一种单个管中管容器的CRISPR/Cas12a驱动的SERS纳米生物传感策略，用于超灵敏检测SARS-CoV-2，并避免了核酸前置预扩增步骤。一方面，本研究探索了利用CRISPR/Cas12a的可编程性和靶标诱导的非特异性DNA切割能力，以及自制的纳米探针构建SERS生物传感策略的可能性，获得更好的检测灵敏度；另一方面，设计了一种管中管(Tube-in-tube) 的低成本反应器，以实现无扩增和抗干扰检测。作者提出的纳米生物检测法平衡了超灵敏度、快速、特异性和现场检测潜力，该方法具有大规模筛查的可拓展性，并可以很容易的在资源有限的地区得以实现。这项工作开启了一个新的基于CRISPR/Cas的检测范式，其有望被拓展到针对其他病原微生物的检测中去。

转自：“NANO学术”微信公众号

如有侵权，请联系本站删除！