PBJ | 烟草细胞蛋白质表达系统中采用了N-糖基工程策略，定向重构内源性N-糖基化途径，以实现定制化的N-糖基结构生产

 N-糖基化是真核细胞中最为重要、复杂和广泛的翻译后修饰之一。N-糖基的存在和组成对蛋白质的折叠、稳定性、功能和免疫原性具有重要作用。然而，在大多数重组蛋白表达系统中，对于N-糖基化等翻译后修饰的控制相对较差。因此，所产生的糖蛋白通常具有显著的异质性，从而影响了各批次间的可重复性。此外，由于不同蛋白质糖基形式的特异性，也限制了其广泛利用。对于治疗性或疫苗性糖蛋白而言，根据N-糖基化位点上的N-糖结构类型，其活性或免疫原性可能存在差异。为了解决这些问题，作者在蛋白质表达系统中采用了N-糖基工程策略，定向重构内源性N-糖基化途径，以实现定制化的N-糖基结构的产生。

近日，比利时鲁汶大学生物分子科学与技术研究所Xavier在Plant Biotechnology Journal上发表了一篇题为“In vivo deglycosylation of recombinant glycoproteins in tobacco BY-2 cells”的研究论文。该研究通过敲除和异位表达参与N-糖基化途径的基因，开发糖基工程的烟草BY-2细胞系，并在BY-2细胞系中产生去糖基化的药物蛋白，扩展了糖基工程BY-2细胞系的应用范围。

作者通过使用抗EndoT抗体进行蛋白质印迹试验，探究了EndoT和EndoT-Venus在细胞系中的分布情况，分别检测到大约70 kDa和43 kDa的条带，与未经加工的完整蛋白质的分子量对应。在总可溶性细胞蛋白（TSCP）和培养基（CM）中也检测到大约32 kDa的条带。EndoT和EndoT-Venus含有N-端和C-端的内源性前蛋白，可以推测在BY-2细胞中会发生前体的加工。这将释放出溶解的EndoT进入高尔基体腔，并最终进入培养基中。

通过具有不同N-糖基化谱的抗体，我们能够研究这些糖基化对蛋白质稳定性的影响。作者进行了差异扫描荧光热稳定性（DSF）实验，也称为热移动实验，以比较不同的IgG2糖基变体的热稳定性。除了本研究中产生的IgG2FG、IgG2ΔX/ΔF、IgG2HM和IgG2MG之外，还分析了之前从独立转基因细胞系中纯化得到的IgG2FG和IgG2ΔX/ΔF样品。根据熔化曲线的一阶导数计算了熔化温度（Tm）。对IgG2FG和IgG2ΔX/ΔF样品进行的DSF实验也得到了类似的结果，从而确认了BY-2生产平台的稳健性。最低的Tm值为60.5°C，对应于IgG2FG，而最高的Tm值为66.9°C，对应于IgG2ΔX/ΔF。IgG2HM和IgG2MG的Tm值分别为63.4°C和61.9°C。与IgG2FG相比，IgG2ΔX/ΔF热稳定性增加了6.4°C，这表明α1,3-岩藻糖苷化或β1,2-木聚糖苷化对IgG2的热稳定性产生了影响。作者还评估了N-糖基对IgG1热稳定性的影响，在WT和XylT/FucT-KO BY-2细胞中产生的hIgG1 Lo-BM2进行了实验。相应的DSF Tm值为62.1°C（IgG1FG）和70.1°C（IgG1ΔX/ΔF），与IgG2所得到的结果一致。

作者在GnTI/FucT-KO细胞系（gBMG）中共表达了gB和EndoT。通过蛋白质印迹分析了GnTI/FucT-KO-EndoT-gB细胞系的TCP和TSCP，使用了针对gB和EndoT的抗体。在大多数转基因细胞系（#17, 18, 19, 23, 25, 29, 30, 33, 34）中检测到了gB的信号。观察到了EndoT特异的信号，但仅在一些转基因细胞系（#19, 29, 30, 34）中存在。对应完整gB的带状图案根据细胞系的不同呈现出明显差异。在不产生EndoT的细胞系中，迁移行为类似于gBHM（#17, 18, 23, 25, 33），而在表达EndoT的细胞系中（#19, 29, 30, 34），对应完整gBMG的带状图案显示出明显的迁移差异。这种迁移差异归因于EndoT对gB上修饰的高甘露糖基的体内加工，与经过不同程度的N-糖基截断的糖基化gB相符合。

综上所述，通过构建一系列糖基工程的BY-2细胞系，成功实现了定制重组糖蛋白的产生。利用单一GlcNAc细胞系，在BY-2细胞中产生了具有最少N-糖基化的重组蛋白。在野生型、缺乏木糖和α1,3-岩藻糖、高甘露糖和单一GlcNAc的BY-2细胞系中，分别表达了IgG2和疫苗抗原gB，并对其N-糖基化的特征进行了分析。结果表明了糖基工程BY-2细胞作为分子农业工具的可行性和适用性。

转自：“植物生物技术Pbj”微信公众号

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