Molecular Plant Pathology| 西瓜的AGO1和AGO5在抗黄瓜绿斑驳花叶病毒中发挥作用
2023/5/29 16:54:43 阅读：35 发布者：
RNA沉默是生物抵御外来核酸的基本抗性机制，AGOs蛋白、DCL 和RDR是该机制的构成成分。目前，西瓜中RNAi途径相关组分及其对病毒病的防御作用尚未被鉴定和揭示。
首先鉴定出7个AGOs、4个DCLs和11个RDRs基因。同时对西瓜和拟南芥AGOs (A)、DCLs (B)和 RDRs (C)蛋白序列进化树分析。
为了探究ClAGOs、ClDCLs和ClRDRs在抗病毒防御反应中的作用，通过CGMMV接种后10天和20天的RNA-seq数据分析了这些基因的表达谱。结果显示，CGMMV侵染使ClAGO1、ClAGO5、ClDCL2、ClDCL4和ClRDR1的转录水平显著升高。通过qRT-PCR检测证实这些基因被CGMMV侵染诱导表达。在模拟接种和CGMMV接种的西瓜叶片中，ClAGO1和ClAGO5的表达量都远高于ClDCLs和ClRDRs ，因此推测ClAGO1和ClAGO5在西瓜抗病毒防御中更重要。
为了验证ClAGO1和ClAGO5的功能，利用本实验室创建的pV190 VIGS来沉默这两个基因，ClAGO1和ClAGO5沉默植株的花叶症状比未沉默植株严重，植株的高度也更矮，在各自的沉默植株中，ClAGO1的表达量下降为对照植株的47% ，而ClAGO5的表达量保持不变；ClAGO5敲低植株中ClAGO5的表达量下降为对照植株的52%，而ClAGO1的表达量没有变化，说明载体对ClAGO1和ClAGO5基因的沉默是特异的。Northern blot分析结果显示，与PDS沉默植株相比，ClAGO1和ClAGO5沉默植株中CGMMV基因组RNA (gRNA)分别增加了120 %和170 %，表明ClAGO1和ClAGO5沉默能增强西瓜对CGMMV的敏感性。
为了进一步分析ClAGO5在抗CGMMV防御中的功能，获得了ClAGO5异源过表达转基因本氏烟株系。接种CGMMV10 d天后，野生型植株系统叶出现明显的班驳、花叶和褪绿的症状，而ClAGO5过表达株系顶端系统叶未表现出明显的斑驳和花叶症状。qRT-PCR检测CGMMV-CP的转录水平， 结果表明ClAGO5过表达株系叶片中CGMMV-CP的转录水平明显低于野生型植株。说明ClAGO5 上调表达对CGMMV的积累有明显的抑制作用 。
由于沉默ClAGO1和ClAGO5都能增加西瓜中CGMMV的积累，因此我们考虑这两个基因之间是否存在相互作用。一系列试验表明ClAGO5与ClAGO1在体内存在相互作用。此外，我们通过酵母双杂交实验发现ClAGO蛋白不能与ClAGO5蛋白互作。
分析发现ClAGO5存在乙烯响应元件，试验表明乙烯处理后6-72h均显著提高了ClAGO5的表达，而ClAGO1的转录水平不受乙烯处理的影响 。定位结果显示，2个ERF和ClAGO5均主要定位于细胞核中，同时，在细胞质中也有分布。这些结果表明，乙烯可能通过这两个ERF转录因子调控ClAGO5的表达，进而激活西瓜RNA沉默抗病毒途径，提高对CGMMV的抗性。
论文第一作者刘美为中国农业科学院郑州果树研究所博士生，通讯作者为古勤生研究员，此外吴会杰，康保珊，彭斌，刘莉铭以及华中农业大学的洪霓教授也参与本研究。课题受到国家自然科学基金，国家西甜瓜产业技术体系和中国农业科学院创新工程项目的资助！
论文链接： https://doi.org/10.1111/mpp.13344
图文来源： Ad植物微生物公众号
转自：“植物生物技术Pbj”微信公众号
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