PNAS | HDR最新进展，Donor-3’悬臂可提高长片段KI效率！

以下文章来源于可研Plus ，作者Written by Rick

2023年5月22日PNAS杂志在线发表了中国科学技术大学梁好均团队关于高效介导HDR的最新研究论文：‘Efficient precise integration of large DNA sequences with 3′-overhang dsDNA donors using CRISPR/Cas9’。

本篇论文探索了一种名为Long dsDNA with 3′-Overhangs-mediated CRISPR Knock-in (LOCK)的新的基因组编辑方法，其能够有效地并准确地将大型DNA片段敲入哺乳动物基因组中。该方法利用经过磷酸硫酯键修饰的特殊3′-悬臂双链DNA (odsDNA) 供体，具有50个核苷酸的同源臂，以避免dsDNA外切酶消化，从而使供体模板更适合用于CRISPR/Cas9基因治疗。LOCK方法采用同源重组修复，实现了高效有针对性的将基因大小的大型DNA片段插入哺乳动物基因组，成本低，脱靶效应低，敲入频率较传统同源重组方法提高了五倍以上。LOCK策略具有优越的特点，未来将适用于使用odsDNA供体进行节省时间和费用的敲入。

Donor 3’悬臂的作用原理

HDR途径本身效率低下，特别是对于较大的DNA给体模板。其中一个原因可以归因于在DSB编辑位点局部可用的外源DNA给体浓度较低。因此，最近的大量工作集中在促进双链DNA（dsDNA）给体模板的核入或增加其稳定性。相比之下，短的单链DNA（ssDNA）供体在长度<200nt的情况下，作为供体模板时显示出更高的KI率，以及与dsDNA供体相比较低的细胞毒性或非靶向改变。

已有研究表明微小同源性指导的碱基配对在DSB修复中比c-NHEJ或HDR更有效；另一方面，短链单链DNA已被广泛用作高效HDR修复的给体，通过非经典HDR介导的单链合并途径（SSA）进行修复。ssDNA供体展示了更高的KI速率和更低的细胞细胞毒性。但是，对于基因大小的KI，制备短链单链DNA是费力和昂贵的。因此，该团队试图设计一个嵌合的“ssDNA-dsDNA”供体，即含有3'-悬臂的双链DNA（odsDNA），预计该供体具有双链DNA和单链DNA供体的优势。

作用过程：非目标链中的3'-悬臂倾向于较早地从Cas9复合物中释放（图1 D，vii），因此与odsDNA或ssDNA的一端结合。相比之下，odsDNA的互补链的另一个3'-末端，可以具有与宿主基因组中目标链上的3'-悬臂互补同源性。在这种情况下，odsDNA给体的两端均含有与切割DSB空挂端互补的同源性序列，从而通过SSA途径进行高效修复（图1 D，viii-x）。

总结

本文介绍了一种新的KI方法LOCK，可以高效地将大的DNA片段转化为哺乳动物基因组的一部分，同时成本低廉、无非特异性效应。该方法采用经过磷硫酸化修饰的特殊3'-overhang双链DNA (odsDNA)，该修饰可以避免DNA被λ外切酶消化。和传统的同源重组方法相比，本方法可以实现>五倍的敲入频率。LOCK策略基于同源重组修复，在基因工程，基因治疗和合成生物学领域具有广泛的使用前景。

转自：“植物生物技术Pbj”微信公众号

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