Nature Plants | 冗余转录因子网络控制拟南芥三萜类化合物时空上的合成

植物有合成一系列特殊的代谢物的能力，在生长、发育、防御与环境的相互作用中起着重要作用。因此，随着代谢物结构的多样性，复杂的调控网络共同进化，以确保相应生物合成途径的正确时空激活，虽然过去已经确定了一些参与激素或应激介导的特化代谢诱导的调节因子，但特化代谢途径的细胞特异性调节的机制尚不清楚。

近日，比利时根特大学VIB植物科学研究所的研究人员在Nature Plants上发表了题为“A redundant transcription factor network steers spatiotemporal Arabidopsis triterpene synthesis”的研究论文。研究人员描述了在拟南芥根尖中细胞特异性生物合成三萜的转录调控网络。三萜骨架thalianol和marneral生物合成途径基因的表达取决于植物激素茉莉酸，并且仅限于外部组织。他们发现这是由来自两个不同分支的冗余bHLH型转录因子的活性促进的，并由同源域因子共同激活。相反，DOF型转录因子DAG1和其他调节因子阻止三萜途径基因在内部组织中的表达。作者展示了三萜生物合成基因的精确表达是如何由转录激活因子、共激活因子和抵消抑制因子组成的强大网络决定的。

研究人员首先对12日龄拟南芥野生型和coi1-1突变型幼苗处理后发现JA处理强烈诱导野生型根中thalianol和marneral BGC的基因表达，coi1-1背景下这种影响被消除或显著降低。此外JA处理的野生型幼苗根系积累的thalianol含量相较于coi1-16突变体中的更高，这些数据表明了COI1依赖的JA信号控制根部三萜的生物合成。

为了进一步绘制thalianol和marneral BGC的时空调控，研究人员在单细胞分辨率下分析了对照和50μM JA处理2小时后根尖的转录变化。对照和JA转录组的统一流形逼近与投影表明，不同细胞类型对JA的响应性存在差异。经JA处理后，在根冠、表皮、皮层、小柱、非生毛细胞和生毛细胞中，thalianol BGC基因均有较强表达。marneral BGC中的基因表达模式与thalianol BGC中的基因表达模式相似，在JA处理后，位于侧根冠、表皮和无壁细胞的表达模式较强。这些结果表明，thalianol 和marneral BGC在根尖的外细胞层特异性表达，并且它们的表达受到JA的强烈激活。

为测定thalianol 和marneral BGC表达是否依赖MYC转录因子，研究人员首先通过RT-qPCR分析单个myc2和三重myc2 myc3 myc4（mycT）突变体中BGC转录物的积累。空白对照中野生型和myc突变体BGC基于转录产物积累没有差异，但在JA处理6小时后，myc2和mycT突变体的根中，JA诱导的thalianol和marneral BGCs中大多数基因的表达显著降低对突变体代谢物分析表面JA处理mycT突变体后与野生型相比thalianol含量显著降低。接下来研究人员在scRNAseq数据集中评估了MYC2、MYC3和MYC4的表达模式，并使用了由相应MYC基因启动子驱动的NLS-VENUS报告基因构建体，染色质免疫沉淀测序显示，thalianol和maral BGC启动子都可以被MYC2和MYC3物理结合。在烟草中进行转录激活分析发现，与对照相比MYC2可以激活所有启动子至少五倍。这些分析支持三个MYC转录因子在三萜生物合成调控中的作用，MYC2可能是这一细胞过程中最重要的。

研究人员为探究其他控制JA反应的因素，他们使用scRNAseq数据所有根尖细胞类型中THAS的基因共表达矩阵。100个共表达最多的基因列表包括thalianol途径基因THAO、THAH、THAR1、THAR2和THAA1，以及 marneral途径基因MRN、MRO和CYP75A12。该分析还确定了bHLH分支Ⅳa转录因子的bHLH19和bHLH20 (NAII)，bHLH19在中柱、侧根冠、表皮和皮层组织中高度表达，在小柱细胞中表达程度较低，且bHLH19和bHLH20的JA诱导性依赖于COI1。研究人员评估了JA诱导的bHLH分支Ⅳa基因的表达是否涉及MYCs。发现与野生型相比，在mycT系中，JA诱导的所有bHLH分支Ⅳa基因的表达均显著降低。通过转录激活实验发现，MYC2D105N触发ProHLH19和ProHLH20的强转录激活，而MYC2则具有中等作用。相反，bHLH19和bHLH20对各自的启动子只有轻微的转录激活作用。因此，拟南芥bHLH分支Ⅳa转录因子基因的表达与的thalianol和marneral BGCs基因相似，是由JA通过涉及COl1和MYCs的规范信号传导模块在根尖外细胞层诱导的。

作者为验证bHLH分支Ⅳa转录因子是否可以直接调节thalianol和marneral 生物合成的表达，通过瞬时启动子转录激活实验表明这些转录因子具有冗余活性和加性活性，这些结果支持MYC和bHLH分支Ⅳa转录因子协同作用，激活三萜BGCs的表达。通过对编码bHLH分支Ⅳa转录因子的四个位点的突变系的表达分析发现，bHLH分支Ⅳa转录因子在这一途径的调控中起主要作用。根据转录数据，与野生型相比，bHLHⅣq突变体的thalanol含量也显著降低。与JA处理后的mycT或bHLHⅣq突变体相比，mycT;bHLHⅣq突变体表现出额外的减少。这些数据证实了bHLH分支Ⅳa和MYC 转录因子在拟南芥根中三萜生物合成调控中的冗余作用。

研究人员定位可能结合到thalianol和marneral BGCs中每个基因的转录因子，以及编码MYC和bHLH分支Ⅳa的转录因子。该分析确定了21个转录因子，其中11个属于DOF家族，7个属于HDG家族，多数DOF型转录因子预计在根尖内层表达，而HDG型转录因子更倾向于在根尖外层表达。

由于HDG家族的成员已被证明参与根萜烯的生物合成和表皮发育，研究人员选择GL2、HDG2和HDG5进行进一步的表征，发现这些HDG转录因子作为根三萜BGCS的共激活因子的冗余作用。对两个可用的gl2突变等位基因进行了基于RT-qPCR的表达分析。gl2功能缺失对两个检测等位基因的影响导致根三萜BGC中基础表达和JA诱导基因的持续下降，这在marneral BGC中最为明显。

研究人员对DOF型转录因子DAG1和vDOF1分析发现DAG1作为三萜途径基因的细胞特异性抑制因子的作用。通过ProCaMV35S启动子表达DAG1，驱动外根细胞层的异位表达，与与野生型相比，JA处理下的三萜BGC中大多数基因的表达显著降低，证实了该TF作为三萜BGC抑制因子在植物中的功能。然而，在空白或JA条件下，dag1和野生型之间没有观察到显着差异，这可能表明存在尚未确定的额外抑制因子的多余功能，将三萜生物合成的表达限制在特定的根细胞中。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41477-023-01419-8

转自：“植物生物技术Pbj”微信公众号

如有侵权，请联系本站删除！