以下文章来源于可研Plus ，作者舟可
背景
腺嘌呤碱基编辑器(ABEs)是一种很有前途的治疗性基因编辑工具。然而，在临床前应用中，基于SpCas9的常用ABEs的大尺寸阻碍了体内传递。尽管之前已经尝试了许多方法来克服这一挑战，例如Cas9衍生版本和许多结构域删除版本的编辑器，但BE和PE系统是否也可以允许这些结构域的删除仍有待证明。
2023年7月11日，BMC biology(IF:5.4)在线发表了吉林大学李占军团队的最新研究成果:'A new compact adenine base editor generated through deletion of HNH and REC2 domain of SpCas9'。在该研究中，作者开发了一个更小的ABE系统—sABE，扩大了其靶向范围，并提供了更高的基因组编辑精度，并且研究结果表明，sABE系统在临床前应用中具有很大的治疗潜力。
ABE、CBE和PE的单域缺失
首先，作者分别删除了AncBE4max、ABE8.17和PE系统的REC2 (Δ174-296)、REC3 (Δ509-672)、HNH (Δ786-855)和RuvCIII (Δ1004-1081)域，得到了一系列新的编辑器（Fig 1a），并利用mCherry/EGFP报告系统来观察上述编辑器的编辑效率（Fig 1b），结果表明，AncBE4max能够以不同的效率耐受这四个结构域的单个缺失。ABE8.17和PE能够容忍REC2和HNH结构域的缺失(Fig1 c,d)。在所有缺失变体中，REC2缺失变体始终显示出最高的效率。但是因为mCherry/GFP结果可能受到编辑器转染效率和表达效率的影响，因此只能作为一个粗略评估。
Fig1
接下来，作者挑选了3个位点来比较AncBE4max变体具体的编辑效率，结果显示ΔREC3和ΔRuvCIII变体无法编辑这三个位点，而ΔHNH和ΔREC2变体的编辑效率明显低于原始的AncBE4max (4 -15%)。PE缺失变异体也产生类似结果。但是ABE的ΔHNH或ΔREC2变体在位点8、17和19的效率与ABE8.17相当。并且ABE8.17的ΔRuvCIII对三个位点中的两个保持了12-23.5%的效率，而ΔREC3无法编辑三个位点中的任何一个(Fig 1e)。为了进一步探索，使用ΔRuvCI和对ABE8.17中的ΔRuvCII(722-755)进行了测试，但这些变体未能恢复EGFP荧光和内源性编辑(Fig1 d-e)。总之，ABE变体保持了高水平的内源性基因编辑，因此作者将重点放在ABE的结构域缺失上进行进一步研究。
REC2和HNH双重缺失产生sABE
验证完单独缺失的影响，作者着手测试多种缺失 (Fig 2a)。对HEK293T编辑后的结果表明：REC2 RuvCIII和HNH REC2 RuvCIII变体几乎完全消除了编辑活性，而HNH RuvCIII在位点8和位点17的编辑效率为5-8%(Fig 2b)。值得注意的是，HNH REC2在三个位点(8-25%)显示出相当高的编辑效率，这与ABE7.10相似(Fig 2b)。因此，作者选择HNH和REC2结构域缺失作为后续研究的对象。
Fig2
在这里，作者将变体中的TadA8e取代TadA8.17，发现mCherry/EGFP报告基因的效率更高。此外，HNH REC2变体效率仍然较高(Fig 2c,d)。因此，不含REC2和HNH结构域的最佳小尺寸ABE8e被命名为sABE。
为了全面评估sABE的基因组编辑功效，作者在HEK293T细胞中靶向了6个内源性基因，结果表明：sABE表现出不同的编辑效率(10.3-43%)，并显著扩展了编辑窗口(Fig 2e）。
sABE的表征与应用
REC2和HNH的缺失使ABE8e从4.8 kb减少到4.15 kb，这与广泛使用的ABE8e-SaCas9-KKH (3.9kb)相当。并且通过比较发现sABE和8e-SaCas9-KKH编辑效率的差异取决于目标位点(Fig 3a)，尽管sABE选择的所有位点的平均编辑效率较低(Fig 3b)。
Fig3
因为结构域的缺失可能会影响ssDNA的可及性、其他蛋白的结合以及DNA的结合和产物，因此会对编辑窗口、抗CRISPR（Acr）蛋白、脱靶等产生影响，作者对此进行了研究，结果表明：
A5和A6位置的编辑率最高，但sABE也允许在13和15位置进行额外的编辑(Fig 3c)，说明sABE在—PAM近端腺嘌呤上表现出更高的编辑活性。
Acr蛋白对sABE的编辑活性有抑制作用，AcrIIA5的抑制作用最强，表明这些Acr蛋白可能不与SpCas9的HNH和RCE2结构域相互作用。
作者发现大多数二核苷酸错配对sABE的编辑效率有显著影响，而ABE8e能够有效地编辑这些错配(Fig 3d)。因此，与ABE8e相比，sABE表现出明显更低的脱靶编辑效率倾向。并且通过编辑分析，结果表明原始的ABE8e相比，sABE系统减少了依赖cas9的脱靶编辑。
在应用方面，sABE系统可以有效地在HEK293T细胞中的疾病相关位点上产生A-G突变。此外，sABE能够在单个腺相关病毒(AAV)载体中以轻微的效率进行体内递送。作者还通过将sABE系统的mRNA和sgRNA微注射到受精卵中，成功编辑了小鼠胚胎基因组（Fig 4）。
Fig4
总结
在这项研究中，作者发现ABE能够耐受REC2和HNH结构域的缺失，而CBE和PE系统则不能耐受这些结构域的缺失。此外，sABE在体外和体内都能实现碱基编辑。与ABE8e相比，sABE精度更高，尺寸显著减小，并具有PAM近端移位编辑窗口。
转自：“植物生物技术Pbj”微信公众号
如有侵权，请联系本站删除！
