上一期（空间转录组测序之实验相关 常见Q&A）介绍了关于在空间转录组实验过程中遇到的常见问题。在基迪奥近两期的空间组学培训中，发现还是有众多老师对自己实验设计中，样本是否适合进行空间转录组测序有一定的疑惑。因此，这一期将专门为大家介绍关于空间转录组测序中样本选择与处理的相关内容。
Q1：组织含水量高的样本如何处理
样本在包埋降温的过程中，样本内的水分会形成冰晶从而刺破细胞。冰晶在－60℃~0℃形成，因此含水量较小的样本，我们采用快速降温的方式快速度过冰晶形成温度带，使样本中的自由水尽可能地形成玻璃化的均匀团块而非冰晶。玻璃化不会出现原生质脱水，因此也不会损害细胞的结构。
图1 水分降温过程中形成大量冰晶
而含水量较高的样本则需要先进行脱水处理，使用30%蔗糖在常温下进行1小时脱水，组织形态不会发生改变，对RNA降解的影响也较小。
Q2：骨样本如何进行空间转录组
目前有许多老师都有咨询过关于做骨样本的空间转录组，但实际上并不是很推荐做相关的测序，主要原因有两点。
一是骨样本在进行正式测序实验之前需要先进行脱钙（钙的存在会影响组织染色和RNA释放），而脱钙会影响芯片的捕获。
二是骨样本细胞密度低。成骨、破骨细胞间的骨代谢平衡对于骨组织微环境的影响甚大，如果是患有骨质疏松的骨样本，骨间的微结构在切片过程中也更容易受到变形或破坏，细胞密度也会更低，并不利于空间转录组测序的数据分析。
图2 骨质疏松患者的松质骨空洞变大，骨内结构易受到变形或破坏
除了这一期提及的骨样本不是很推荐进行空间转录组测序外，上一期提过的关于植物的成熟组织由于液泡大、活细胞核密度较少等原因也不是很推荐进行空间转录组测序。
Q3：肿瘤样本如何设计对照组和实验组
肿瘤是如今对人类健康负荷最大的疾病，难以突破的五年生存率和高昂的治疗费用对患者和患者家庭都是巨大的压力。所以，对于肿瘤的研究一直是科研领域最大的项目投入。
空间转录组对肿瘤微环境的解析能力为更进一步了解肿瘤的发展、免疫机制提供了良好的契机。而空间转录组的性质使得其实验设计较其他组学也有所不同。根据研究目的的不同，我们可以采用不同的取样方式。
（1）研究肿瘤微环境的景观变化
这种方法可以只取位于肿瘤与正常组织交界处的样本，可以同时获得癌与癌旁的组织，检测肿瘤发生病变或增殖时有哪些特异性高表达或低表达的基因，通过对这些基因进行富集分析以及GSVA分析等挖掘肿瘤的发病机制以及肿瘤微环境的景观变化。
图3 肿瘤与肿瘤邻近正常组织
（2）研究免疫、肿瘤微环境景观差异
如肿瘤组织较大，不方便同时获取癌与癌旁的组织块，又想研究免疫、肿瘤微环境变化的话，可以选择取三组样本：肿瘤中心、肿瘤边界以及临近正常组织。这样既可以研究肿瘤组织与正常对照组织间的微环境变化，还可以通过比对肿瘤边界的组织微环境变化去探究肿瘤的发病机制与关键的治疗靶点等。
（3）研究原发、复发肿瘤或混合瘤的异质性
做空间转录组测序时可能会出现一种特殊情况，像人的皮肤样本，正常组织比较难透化，而发生癌变后，组织的微环境发生了变化，能透化出RNA，就能检测到基因表达。像这种正常组织无法得到比对数据的，就只能取病变的样本了，那对于研究肿瘤内或肿瘤间的异质性可谓再适合不过了。
Q4：空间转录组需要几个生物学重复
目前做空间转录组测序是可以不做生物学重复的，主要涉及以下两个原因。
首先，空间转录组技术现今还是属于新兴的技术之一，像转录组测序以及单细胞转录组测序等测序技术在刚出的前几年也都是不要求做生物学重复的，算是新技术的一个红利吧。
其次，空间转录组其实很难实现生物学重复。由于组织空间内部结构具有一定异质性（这也是空间转录组的研究对象），要求每个样本切片时的方位与深度等都一致，才能得到对应的生物学重复切片，这减少了生物学重复设置的意义。
说句题外话，关于连续切片的方式其实只是切片的技术重复，本质上还是在同一个组织样本上完成的切片样本收集，不能算作是生物学重复。
图4 小鼠脑的连续矢状切面样本 H&E染色
Q5：单细胞+空间多组学，如何进行取样
空间转录组实现了转录本所属组织的还原，但是，空间转录组的每个spot实际包含了1-50个细胞。通过空间转录组，我们只知道转录本在什么位置，而不知道每个位置由哪些细胞构成。我们可以将空间转录组的每个spot看作普通转录组的一个样本，利用单细胞转录组测得的每种细胞类型的表达量特征来推算每个spot潜在的细胞组分构成，从而将空间转录组图谱升级成空间细胞组成图谱。那关于两个组学技术的取样方式呢，也是有三种方案供大家选择。
图5 染色切片与spot亚群图
第一种方案是在一开始样本收集的过程中，直接将样本一分为二。一份用于做空间转录组测序，另一份用于做单细胞测序。这个方案的优点是样本新鲜，单细胞悬液制备效果好，提高了单细胞转录组数据的可靠性；不足之处是对样本需求量较高，同时，因为样本一分为二，可能会引起两组学关联性降低。
第二种方案是仅适用于空间转录组测序冷冻包埋方式的实验设计。可以在得到冷冻包埋样本后先进行空间转录组测序。将剩余样本置于液氮保存，等之后想做单细胞测序的时候再解冻样本，制备单细胞核悬液上机建库测序。相比之下，第二种方案获得的两组学数据同一性会更强，样本需求量会比较低，可以在空间转录组分析过程中有需求再增加单细胞测序，可调整性会更强；不足之处是单细胞测序只能使用核悬液，对包埋块保存要求较为严格，需尽可能减少水分挥发。
第三种方案则是仅做空间转录组测序，使用前人已发表的单细胞测序数据进行多组学联合分析。当然，这种方案也受限于已有对应物种、组织的公开单细胞测序数据，比起第一种方法来说虽然鉴定的可靠性没有那么多，但是可以省下单细胞测序的成本也未尝不是一种好方法。
总结一下，如果经费允许的话，可以选择前两种方案,数据可靠性强。如果空间转录组样本选用的是石蜡包埋样本则采取第一种方案，样本量较少或冷冻包埋样本可以选择第二种方案；如果经费有限，且相关的单细胞测序研究结果较多，那第三种方案可谓是性价比之王了。
转自：基迪奥生物
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