Part1
细胞凋亡的早期形态学改变是核染色质浓聚、固缩,聚集在核膜周边,然后是胞浆浓缩、胞膜起泡,继而细胞核裂解成若干碎片,细胞膜将胞质和染色质断片包裹,胞浆内形成多个膜结构尚完整的“小泡”及 “凋亡小体” (apoptoticbody)。这不同于细胞坏死的细胞肿胀、胞膜破裂、细胞崩解。
根据凋亡细胞固有的形态特征，至今为止，人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法。
一、光学显微镜观察
凋亡细胞的主要特征为核染色质致密深染，形成致密质块，有时可碎裂。在HE染色的组织切片中细胞体积缩小，胞质致密、嗜酸性染色增强，并可形成凋亡小体。在组织中凋亡细胞常以分散单个形式存在，凋亡细胞与周围细胞分离，不引起炎症反应。
本方法简便易行，但在细胞密集的组织中对于改变不典型的细胞判断较困难，常缺乏较为特征的指标，具有较强的主观性，重复性差。本方法可用于调亡现象的初步观察，作为分析指标之一。
检测方法：细胞涂片或组织石蜡切片作HE染色或Giemsa染色，在高倍物镜下观察凋亡细胞的形态改变，结合显微测量工具可作凋亡细胞计数。
二、视频时差显微技术
本方法用于细胞培养，通过相差显微镜可动态观察细胞凋亡的变化过程，尤其是观察细胞表和外形的变化。凋胞与基质分离，胞体变圆、收缩、出泡，有的细胞拉长，出现钉状突起，特续数小时后细胞膜破裂，细胞溶解，通过连续观察，本方法可养壑培养中的凋亡细胞，但不能用于病理组织。
检测方法：收集2×105细胞/ml培胞，置于多孔培养板，加入凋亡诱导剂，在带有自动摄像装置的相差显微镜下观察凋亡细胞的动态改变，每隔分钟30秒作序列摄影，连续24小时。如同进进行荧光染色，可参荧光晃微镜下观察和摄影。
三、电子显微镜观察
虽然光学显微镜下可以看见胞膜起泡现象和凋亡小体,但凋亡细胞的形态学变化大多发生在超微结构,因此用光镜观察难以令人满意,而透射电镜可清楚地观察到细胞结构在凋亡不同时期的变化。电镜形态学观察是迄今为止判断凋亡最经典、最可靠的方法,被认为是确定细胞凋亡的金标准。
缺点：
(1)只能定性,不能定量;
(2)标本处理过程复杂,设备相对昂贵,对检查者的技术水平要求较高,不适于大批标本检测;
(3)在组织切片上进行电镜观察时,有时凋亡很难与正常细胞有丝分裂相鉴别,因为两种情况下都可出现染色质浓聚。如同时进行荧光染色,可弥补电镜检查的不足。
检测方法：透射电镜标本经戊二醛和饿酸双重固定，丙酮脱水，环氧树脂包埋，超薄切片，醋酸枸椽酸电子又重染色，透射电镜观察。扫描电镜标本经戊二醛和饿酸双重固定，乙醇逐级脱水，CO2临界点干燥，真空喷金，扫描电镜观察。
四、流式细胞技术流式细胞仪检测凋亡细胞是通过检查其光射特征及荧光参数时行的。细胞穿过流式细胞仪的激光束集点时使激光发生散射，分析散射光可以提供细胞大小及结构的信息。散射光包括前向散射光和左向角散射光两种，前向散射光的强度与细胞大小、体积相产，右向角射光的强度与细胞结构的析射性、颗粒性（granu-larity）有关。
细胞凋亡过程中出现的形态改变如细胞皱缩、胞膜起泡、核浓缩和碎裂等可以使光散射特性发生改变。早期凋亡细胞主要表现为前向散射光减弱而右向角散射光增强或不变，前者反映了细胞的皱缩，后者反映了细胞的核逐缩及碎裂。晚期凋亡细胞的前向散射光和右向角散射光均减弱。
由于光散射牧场生并非凋亡细胞的特异性指标，细胞的机械性损伤和细胞坏死也可以使前向散射光减弱。因此，只有将光散射特性的检测与荧光参数的检测结合起来才能准确地辨认凋亡细胞。
细胞凋亡过程中核酸内切酶在DNA分子核小体间的降解，导致小分子DNA漏出，核DNA含量下降，细胞荧光染色后作流式细胞仪分析，可以发现在DNA直方图上正常二倍体细胞的Go/G1峰前出现一个亚二倍体峰（xub-G1峰，即AP峰--apoptotic peak）,代表凋亡细胞。
根据此亚二倍体峰可以计算凋亡细胞的百分率。此外，流式细胞术还可以通过测定线粒体膜的电位、溶酶体质子泵的活性及细胞DNA/总蛋白质比例等方法辨认凋亡细胞。
检测方法：获取密度1×106细胞/ml左右的细胞悬液，精洗，固定，荧光染料染色，上流式细胞仪分析。
Part2
早期凋亡细胞及活细胞的胞膜正常，DNA染料碘化丙锭(PI)拒染，但可被另外一种DNA染料Hoechst342(Ho342)染色；而坏死细胞的胞膜完整性受到破坏，细胞不需固定即可被PI染色。凋亡细胞的胞膜成分亦发生改变，在凋亡早期，原来位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸(PS)迁移至脂双层外侧。另外，细胞凋亡时核酸内切酶被激活，首先将DNA切成50～300kb大小的DNA，然后进一步将染色质裂解成单个核小体和寡聚核小体，形成180～200bp的DNA片断。而坏死细胞DNA断裂无规律性。
接下来我们来看看细胞凋亡的生物化学检测方法。
一、Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测方法
原理：在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸只分布在细胞膜脂质双层的内侧，细胞发生凋亡最早期，膜磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧，这一变化早于细胞皱缩、染色质浓缩、DNA片断化和细胞膜的通透性增加等凋亡现象。
AnnexinV是一种磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此AnnexinV被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。
碘化丙啶（Propidium Iodide,PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但凋亡中晚期的细胞和死细胞由于细胞膜通透性的增加，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。
因此，将Annexin V与PI联合使用时，PI 则被排除在活细胞（Annexin V-/PI-）和早期凋亡细胞（Annexin V+/PI-）之外，而晚期凋亡细胞和坏死细胞同时被FITC 和PI 结合染色呈现双阳性（Annexin V+/PI+）。
检测方法：1.按照既定程序诱导细胞凋亡；2.按照说明书配制所需溶液；3.常规制备单细胞悬液，用冷PBS洗两次后，取约5×106个细胞，1500rpm离心，弃上清，将细胞悬浮在400 µl×结合溶液中；4.将细胞悬液分成5管，每管约1×106个细胞，阴性对照管不加任何试剂，阳性对照管加2%多聚甲醛固定30分钟，用FITC标记Annexin V和PI双染，余下3管，其中1管只加10 µl PI，1管只加5 µl FITC标记Annexin V，最后一管加10 µl PI和FITC标记Annexin V混合，室温孵育15分钟；5.每管各加400 µl 1× 结合缓冲液上机检测。
注意事项：A.确定细胞凋亡发生的时间，PS外翻只发生在细胞凋亡早期，建议先观察细胞凋亡的形态后决定取样检测时间；B.由于EDTA会络合Ca2+离子，影响Annexin V与PS的结合，因此建议不用含EDTA的胰酶消化贴壁细胞。细胞经过胰酶消化后可能导致胰酶对细胞的进一步作用从而导致细胞的进一步凋亡，建议在用胰蛋白酶处理前单独收集培养液中悬浮的细胞，保存在2%的BSA中。
二、磷脂酰丝氨酸单抗（PS）检测法
原理：与Annexin V相比，PS的抗体可以直接用来检测细胞凋亡过程中PS的外翻，而且灵敏度高，特异性强，信号持续时间久，费用更低。
三、TUNEL法
原理：TUNEL的全称是Terminal Deoxynucleotidyl Transferase mediated dUTP Nick-End Labeling，中文名为末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP原位切口末端标记。
细胞凋亡中染色体DNA的断裂是个渐进的分阶段的过程，染色体DNA首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50-300kb的大片段。然后大约30 ﹪的染色体DNA在Ca ²+和Mg²+依赖的核酸内切酶作用下，在核小体单位之间被随机切断，形成180～200bp核小体DNA多聚体。DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的3’-OH末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3’-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法一般称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）。
由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3’-OH形成，很少能够被染色。低分子量的DNA分离后，也可使用DNA聚合酶进行缺口翻译（nick translation），使低分子量的DNA标记或染色，然后分析凋亡细胞。
TUNEL或缺口翻译法实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确的反应细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞凋亡测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，灵敏度远比一般的组织化学和生物化学测定法要高，因而在细胞凋亡的研究中已被广泛采用。
不足之处：
(1)坏死细胞亦有DNA裂点形成,也可呈现TUNEL反应阳性，因而特异性较差。据报道，TUNEL反应中坏死细胞的标记量比凋亡细胞的标记量少一个数量级。
(2)TUNEL结合免疫组化检测时，固定过程对检测的影响较大，切片的大小、薄厚会直接影响到固定效果，从而产生结果的差异。
四、ISOL检测法
原理：与TUNEL凋亡检测法类似，ISOL（In Situ Oligo Ligation，原位寡核苷酸片段连接）也是通过末端标记断裂DNA的方法。但该方法的创新在于利用ISOL方法，在DNA片段的平端或3’端单个突出碱基进行连接扩增，鉴于只有发生凋亡的细胞才会发生平端或3’端单个碱基突出，所以ApopTag 过氧化物酶ISOL凋亡检测试剂盒能够明确的区分凋亡细胞和坏死细胞。
优势：原位特异标记，能够最大限度的降低背景，克服TUNEL法检测的假阳性，适用于石蜡包埋的组织、冰冻组织、贴壁细胞以及悬浮细胞的凋亡检测。
五、DNA凝胶电泳(DNAladder)
凋亡过程中DNA裂解是标志细胞最终走向死亡的不可逆的重要过程，DNA凝胶电泳也曾被认为是细胞凋亡判定的金标准之一。抽提细胞的DNA,确定样品中DNA的量和纯度，然后在琼脂糖凝胶上电泳。正常活细胞的DNA凝胶电泳为一条区带;细胞凋亡时，由于DNA被裂解成单个核小体和寡聚核小体，电泳时呈现特征性的“阶梯状”(ladder)条带，坏死细胞的DNA是被随机破坏的，不能形成阶梯状条带，电泳时出现类似血涂片的连续性改变。此方法是判断细胞有无凋亡发生的一种简便方法，比较适用于体外培养的非增殖性细胞的检测。
缺点：
(1)特异性较差，特征性的180～200bpDNA梯带的出现并非凋亡所独有，另外在某些罕见的情况下细胞发生凋亡可无DNA断裂；
(2)不能提供单个细胞或相关细胞的组织学定位或细胞分化等凋亡信息；
(3)不能进行准确定量，只能进行半定量；
(4)灵敏性较差，要求所测标本细胞数在1×106以上才能使电泳清晰；
(5)适用于只含有单一细胞成分标本的测定，对组织细胞组成复杂者，不能确定凋亡发生于哪类细胞。
六、酶联免疫吸附法（ELISA）核小体测定
ELISA是定量检测细胞凋亡的免疫化学法，其基本原理是利用夹心ELISA方法检测细胞凋亡后形成的由组蛋白及DNA片断组成的核小体。在微定量板上吸附抗组蛋白抗体，加入细胞裂解后离心所得的含有核小体的上清液，核小体上的组蛋白与包被的抗组蛋白抗体结合；加入辣根过氧化物酶标记的抗DNA抗体，与核小体上的DNA结合；加酶的底物，测光吸收值。此方法敏感性高，所需细胞数少，可检测低至5×102/mL的凋亡细胞。此外，此方法不需特殊仪器，比较适合基层工作。
缺点：
(1)不能精确测定凋亡发生的绝对量；
(2)适合单一成分细胞的检测，对于多细胞成分的组织或细胞混合物，不能判定凋亡发生在哪种细胞；
(3)不能提供单个细胞或相关细胞的组织学定位。
转自：医学科研小坑
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