点我关注 科研课程大全 2022-04-25 21:01
生物医学是实验科学，需要通过实验来进行分子表达检测、表型检测和机制验证，以实验证明理论正确性。
然而，想要做好基础实验并不是一件容易的事，需要研究人员花费大量时间和精力在实验室，重复实验操作，才能输出实验成果。
解螺旋为大家整理出14个基础实验详尽教程！里面不仅包含了实操步骤，并且贴心总结了实验过程中常见问题及对策
WB实验中出现不好看的条带
1. 不好看的条带大多是因为蛋白酶降解，造成条带出现在奇怪的位置。建议使用已经保存在冰上的新鲜样品或换抗体。
2. 如果蛋白质位置比较高，重新加热样本可以帮助打破蛋白质的结构。
3. 模糊的条带经常是因为转染过程中电压过高或气泡，应确保凝胶在较低的电压下运行，以及转染的三明治避免产生气泡。另外，换新的电泳缓冲液 可能也可以帮助解决问题。
4. 条带不平滑，可能是由于阻力低导致穿过蛋白质凝胶的速度过快，因此要选用质量较好的样品。
5. 白色条带是由于蛋白质或抗体太多了。
qPCR 扩增曲线不稳定
可能原因：RNA 纯度低；体系中存在较多杂质；仪器使用时间过长。
解决方案：
1) 提取高纯度的 RNA，小心操作；
2) 对仪器进行校准。
IHC边缘效应
可能原因：组织边缘贴附不牢，边缘组织松脱漂浮于液体中；试剂未充分覆盖组织。
解决方案：
APES/多聚赖氨酸处理玻片；组织切片尽量薄；尽量避免选用坏死较多的组织；滴加试剂时让试剂完全覆盖组织。
一、7个基因表达检测实验
包含7个基因表达检测详尽教程，如rtPCR、PCR引物设计、RNA抽提、RT-qPCR、WB实验、IHC实验、免疫组化图像分析。
每个实验都详细介绍了样品制备、操作要点、数据分析……
1rtPCR
rtPCR 技术可以分解为：RNA 抽提、反转录、PCR、PCR 产物检测。
2PCR 引物设计
PCR，相信我们都不陌生，是一种选择性体外扩增DNA或RNA片段的方法，即通过试管中进行的DNA复制反应，使极少量的基因组DNA 或RNA样品中特定基因片段在短短几小时内扩增上百万倍。
3RNA抽提
RNA抽提有很多种方法，其中TRIzol法是最流行的。
TRIzol法很快速，且能抽提多种属总RNA，对少量的组织和细胞以及大量的组织和细胞都能有效分离，能抽提不同分子量大小的多种RNA，避免DNA和蛋白的污染，抽提出来的RNA适用于多种实验。
4RT-qPCR
以cDNA为模板进行PCR，在PCR扩增过程中，通过收集荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct 值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以可以定量。
5WB实验
蛋白免疫印迹（Western Blotting）是将电泳分离后的蛋白质从凝胶转移到NC膜或PVDF膜上，然后用特异 性抗体检测某特定蛋白的一种蛋白质检测技术。
6IHC实验
免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）利用抗原与抗体特异性结合的原理，使用抗体去标记组 织细胞内的蛋白质，然后通过化学反应使抗体显色来确定组织细胞内的蛋白质的位置和表达量。
7免疫组化图像分析
使用软件Image-Pro Plus 6（IPP6）分析单张免疫组化图像、多张免疫组化图像以及批量分析免疫组化图像，包括校正图片、选定测量项目、选定测量范围、测量、输出数据等详细步骤。
二、7个基因表达操作实验
1过表达
基因过表达操作流程为构建基因过表达载体——转染——检测过表达效果。
2融合基因表达
构建融合基因克隆的重点在引物设计，而引物设计要点在——不能移码！不能中间就终止！
3长片段/突变基因表达
长片段/突变基因克隆的重点在引物设计和 PCR。
4RNAi
RNAi 技术的重点在 siRNA 设计，siRNA 设计优先使用文献中或预设计siRNA库中已经验证过的siRNA靶点，实验时同时使用多个有效靶点以排除脱靶效应，既可以直接使用siRNA片段，也可以使用shRNA来进行RNA干扰。
5miRNA 靶序列寻找
microRNA（miRNA）是一类长度在 22nt 左右的小 RNA 分子，它并不编码 蛋白质，因此 miRNA 与 siRNA 和 circRNA 等小 RNA 分子一样，也是一种非编 码 RNA。
6miRNA QPCR 检测
在做qPCR的过程中，常常会出现各种问题，让初学者一筹莫展，要debug，首先要明白bug是怎么出现的，才能对症下药。
7流式检测细胞周期
PI法是经典的周期检测方法，PI为插入性核酸荧光染料，能选择性地嵌入 DNA双链螺旋的碱基之间与之结合，其结合的量与DNA的含量成正比例关系，用流式细胞仪进行分析，就可以得到细胞周期各个阶段的DNA分布状态，从而计算出各个期的百分含量。
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