RNA导向系统，如CRISPR-Cas，将可编程底物识别与酶功能结合起来，这一组合已被有利地用于开发强大的分子技术。这些系统的结构研究阐明了RNA和蛋白质是如何共同识别和切割它们的底物的，为进一步的技术发展提供了合理的工程指导。最近的研究发现了一类新的RNA导向系统，称为OMEGA（Obligate Mobile Element Guided Activity），其中包括可能是Cas9的祖先的IscB和缺乏HNH核酸酶结构域的IscB的同系物IsrB。IsrB只包含大约350个氨基酸，但它较小的体积被一个相对较大的RNA引导(大约300 nt ωRNA) 所平衡。
2022年10月12日，麻省理工学院和哈佛大学 Broad 研究所张锋团队在Nature 杂志在线发表题为“Structure of the OMEGA nickase IsrB in complex with ωRNA and target DNA”的研究论文，该研究报道了脱硫弧菌IsrB (Desulfovirgula thermocuniculi IsrB, DtIsrB) 与其同源的ωRNA和靶DNA的复合体的冷冻电镜 (Cryogenic electron microscopy, cryo-EM) 结构。
研究发现IsrB蛋白的整体结构与Cas9共享一个支架。然而，与Cas9使用识别 (recognition, REC) 部分来促进目标选择不同，IsrB依赖于它的ωRNA，其中一部分形成了一个复杂的三元结构，定位类似于REC。总之，通过对IsrB及其ωRNA的结构分析，以及与其他RNA引导系统的比较，突出了蛋白质和RNA之间的功能相互作用，促进了我们对这些不同系统的生物学和进化的理解。
RNA引导的IsrB蛋白是编码在转座子IS200/IS605超家族中的OMEGA家族成员。根据系统发育分析和共享的独特结构域结构，IsrB可能是IscB的前身，而IscB是另一个OMEGA家族成员，是Cas9的明显祖先。与IscB和Cas9一样，IsrB包含一个Ruvc样核酸酶结构域，该结构域被桥螺旋(bridge helix, BH)的插入所中断(图1a)。然而，与IscB和Cas9相比，IsrB缺少HNH核酸酶结构域、REC叶和大部分原间隔相邻基序- (PAM-)相互作用域，因此，它比Cas9要小得多(大约有350个氨基酸)。此外，IsrB还包含一个N 端PLMP结构域 (以其保守氨基酸基序命名) 和一个未特征化的C端结构域 (图1b)。先前的研究表明，IsrB与一个大约300 nt ωRNA结合，引导IsrB切割含有5 ' -NTGA- 3 '靶邻基序 (target-adjacent motif, TAM) 的双链 (double-stranded, ds) DNA的非靶链。
为了追溯从IsrB到Cas9的蛋白结构域进化，研究人员将IsrB的结构与已知的最大的IscB之一 (one of the largest known IscBs, OgeuIscB) 的结构进行了比较，OgeuIscB是IsrB的一个远亲，包含HNH核酸酶结构域，以及预测的YnpsCas9-1(一种早期分支的II-D亚型Cas9，是与IscB最相似的Cas9之一)的结构。
图1. IsrB - ωRNA -target DNA复合体的cryo-EM结构（图源自Nature ）
除了在IscB中的HNH结构域外，研究人员还观察到在其他区域有很大的差异。例如，在一些但不是所有的IscB分支中，RECL大于IsrB中相应的连接子区域，并折叠成最小的二级结构，而在YnpsCas9-1中，REC区域获得了一个大的球状结构域。在其他Cas9中，例如SpCas9，这个区域甚至更大、更复杂。
为了更详细地描述ωRNA进化为cr/ tracrRNAs时的最小化，研究人员将DtIsrB ωRNA (DtRNA)的结构与OgeuIscB ωRNA (OgRNA)、CjCas9单导RNA (CjCas9 single-guide RNA, CjRNA)和SpCas9 sgRNA在蛋白质/目标DNA结合状态下的结构进行了比较。根据拓扑、位置和二级结构，绘制了在其他RNA物种中DtRNA的结构特征，并将未识别的结构基序命名为基序1-5 (M1-5)。发现在所有四种RNA中，5′-stem region (DtRNA中的S1和SL1) 和连接区(DtRNA中的S2)的结构都是保守的。DtRNA 5′-stem region (SL2)的一个嵌入茎环与连接区(SL5)的一个嵌入茎环配对，形成一个功能性假结，识别目标DNA。
为了更好地理解在IsrB和Cas9从紧凑的Ruvc类祖先进化过程中与领域获取相关的机制变化，研究人员比较了Thermus therophilus RuvC (TtRuvC)、IsrB、CjCas9和SpCas9的靶结合结构。随着含RuvC结构域的蛋白质进化到与ω rna相互作用，它们获得了TI/PI、PLMP和BH结构域。虽然IsrB和Cas9共享同源的RuvC和BH结构域，但IsrB(以及IscB)唯一包含PLMP结构域，PLMP结构域与RuvC i直接相互作用。对IsrB结构的研究进一步揭示了PLMP结构域在稳定ωRNA末端发夹碱基和接触Shine-Dalgarno序列（细菌和古细菌中信使RNA中核糖体结合位点序列）方面的作用。
图2. 冷冻电镜密度图和结构模型（图源自Nature ）
相对较大的ωRNA(大约300 nt，而Cas9使用100 nt sgRNA)似乎有助于DNA靶向和切割活动之间的联系，补偿了小的RECL和HNHL区域。在多层ωRNA结构中，上层RNA螺旋(S2/S3/S4/SL2/SL4/SL5)与下层RNA螺旋(SL7/SL8)相互作用，形成了ωRNA驱动的异质双工识别的相互作用网络，并通过S2、SL4和SL7之间的连接伪结相互作用与切割模块(PLMP/RuvC/TI结构域)广泛相互作用。鉴于ωRNA中功能性假结的突变消除了IsrB的切割活性。
总之，未来对IsrB在其他构象中的结构研究，如催化活性的IsrB R-loop络合物，将进一步加深我们对OMEGA这类新的可编程的DNA编辑系统的机制理解。
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https://www.nature.com/articles/s41586-022-05324-6
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