目前，体外DNA切割和分子克隆的方法仍然不能精确地切割直接邻近的目标DNA。限制性内切酶 (restriction enzymes, REs) 必须结合特定的基序，CRISPR-Cas核酸酶以可编程的方式切割DNA，在体外分子应用中比REs更有优势。然而，野生型CRISPR-Cas9或CRISPR-Cas12核酸酶则依赖于原间隔相邻基序 (protospacer adjacent motifs, PAMs)。
2022年10月6日，美国麻省总医院Benjamin P. Kleinstiver团队在Nature Biotechnology 杂志在线发表题为“Precise DNA cleavage using CRISPR-SpRYgests”的研究论文，该研究利用近无PAM的SpCas9变体，被命名为SpRY，作为一种通用的DNA切割工具，应用于各种克隆。
通过使用超过130种gRNAs (guide RNAs) 对多种PAMs进行SpRY DNA消化 (SpRY DNA digests, SpRYgests)，发现SpRY在体外无需PAM，可以在几乎任何序列上切割DNA，包括与野生型SpCas9不可切割的位点。总之，SpRYgests受益于精确的DNA断裂以改善各种DNA工程应用。
大部分Cas酶的DNA靶向特异性是由一个gRNA提供的，该gRNA可以被编程为与几乎任何序列结合。然而，传统的Cas9和Cas12核酸酶也被要求识别与靶位点相邻的短DNA基序，即PAM所阻碍。由于依赖于靠近目标位点的PAM的可用性，阻碍了对DNA的精确切割。
事实上，虽然之前的方法曾尝试使用Cas9或Cas12酶进行体外DNA消化，但由于Cas酶对PAM的限制或Cas12a引起不可预测的双链断裂 (double-strand break, DSB) 末端，因此这些尝试仍缺乏精确的靶向性和灵活性。
在这项研究中，研究人员设计了一种几乎无PAM的CRISPR-Cas变体——SpRY，它可以靶向人类细胞中具有NNN PAMs的DNA位点，并优先选择NRN PAMs而不是NYN PAMs (其中R为a或G, Y为C或T)。
图1. SpRYgest系统（图源自Nature Biotechnology ）
研究人员首先研究了野生型 (wild-type, WT) SpCas9或SpRY利用不同PAMs的切割活性。通过从人类细胞裂解物中过表达的Cas9蛋白和SpRY的细胞裂解产物，同时设计对应的20种gRNAs（NRN和NYN PAMs），进行体外酶切处理以分析对靶位点处切割线性化质粒的能力。结果表明，WT SpCas9酶切的20个位点中仅有4个有较完全的酶切活性（>80%酶切效率），而SpRY有19种gRNAs靶位点处均有较完全的酶切活性。这些结果证明SpRY在体外可以作为一种有效的无PAM内切酶。
图2. WT SpCas9和SpRY对线性化质粒底物的DNA切割效率（图源自Nature Biotechnology ）
为了进一步评估SpRYgests的无PAM性质，研究人员使用64种gRNAs对WT SpCas9、SpG (一种SpCas9变体，之前设计为NGN PAMs靶向位点) 和SpRY进行了大规模比较，这些gRNAs靶向一系列NNNN PAM，其中第2 /3 /4位位包含所有碱基组合。Cas9和SpG的PAM序列特异性与之前研究类似，而SpRY则在59/64种gRNAs处有较完全的酶切活性。进一步分析表明，SpRY的体外活性几乎不受PAM限制，但当PAM为NYN或gRNA紧邻PAM的碱基为C时，其切割活性有一定程度降低。
不仅如此，研究人员证实SpRYgests在37 °C条件下能有效切割纳克和微克级别的DNA模板。与基因组编辑实验一样，脱靶切割也可能出现在SpRYgests中。研究人员发现SpRY的脱靶水平极低，这可能是由脱靶的DSB引起的。通过使用针对对面链上更特异的次级gRNA可以完全缓解脱靶切割，使用SpRY的高保真版本SpRY- HF1也可减少体外脱靶切割，特别是在较早的反应时间点。
总的来说，与野生型SpCas9相比，该研究以SpCas9突变体SpRY为基础开发的SpRYgests系统，在体外基本上是无需PAM就能够对DNA分子进行高度精确的酶切。SpRYgests克服了REs、经典CRISPR-Cas酶和其他核酸酶的靶向限制，允许单核苷酸分辨率的DNA裂解。不仅如此，该研究还优化了SpRYgests的各个方面，包括gRNA的生产，以实现快速、低成本和精简的工作流程。精确使用SpRYgests对于多种分子DNA应用具有显著优势。
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https://www.nature.com/articles/s41587-022-01492-y
转自：“iNature”微信公众号
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