NBT | CRISPR-SpRYgests：体外精准切割DNA的新型工具

体外DNA切割和分子克隆的方法不能实现精确切割与目标碱基直接相邻的DNA。限制性内切酶(REs)必须结合特定的基序，其特异性对精确克隆方法提出了挑战，CRISPR-Cas核酸酶以可编程的方式切割DNA，在体外分子应用方面比限制性内切酶占据了优势，而野生型的CRISPR-Cas9和CRISPR-Cas12核酸酶也需要识别靶位点附近的原间隔相邻基序，CRISPR-Cas9和CRISPR-Cas12核酸酶对于DNA底物的精确切割依赖靶标近端PAM，研究人员曾使用Cas9或Cas12核酸酶进行体外DNA切割，但由于Cas核酸酶对PAM需求或Cas12a双链断裂末端的不可预测性，导致Cas核酸酶靶向的精准性和灵活性大大降低。为了克服PAM的限制， Benjamin P . Kleinstiver团队设计了一种几乎没有PAM限制的CRISPR-Cas变体，名为SpRY，它可以靶向人类细胞中带有NNN PAMs的DNA位点，偏好于NRN PAMs而不是NYN PAMs(其中R为A或G, Y为C或T)。

近日，美国科研人员在国际知名期刊 Nature Biotechnology 上在线发表了题为“Precise DNA cleavage using CRISPR-SpRYgests”的研究论文，研究人员发现SpRY在体外基本上是不受PAM的限制，能够对DNA分子进行高度精确的切割。SpRYgests（SpRY DNA digests）克服了限制性内切酶(REs)、经典CRISPR-Cas酶和其他核酸酶的靶向限制，允许单核苷酸分辨率的DNA切割。接着研究人员优化了SpRYgests的各个方面，包括gRNA生产，以实现快速、经济和精简的工作流程。

研究人员首先评估了WT SpCas9和SpRY对线性化质粒底物的DNA切割效率，设计了20个sgRNA（PAM为 NRN和NYN）， 其中， 12个gRNAs以1-bp的间隔靶向特定区域，8个gRNAs分布在整个底物上，在两次实验中，WT SpCas9只切割了这20个位点中的4个，而SpRY对20个gRNA中有19个接近完全切割，接着，研究人员使用64个额外的gRNAs（PAM为NNNN）对WT SpCas9、SpG和SpRY的DNA切割效率进行进一步评估，与之前的报告类似，当WT SpCas9以含有NGG PAMs的gRNAs为靶点时，可以有效地切割化底物，有时还对含有NAG、NGA或移位的NNGG PAMs的位点表现出活性，SpG对NGN的PAMs位点表现出活性， SpRY对64个gRNAs中的59个gRNAs完全切割，两个gRNAs的底物部分切割，剩余三个gRNAs表现出低到无活性。研究人员接着用SpRY研究了底物切割不完全的原因，发现PAM不是底物不完全切割的主要决定因素，综合结果表明了SpRY在体外切割的灵活性和有效性，93.2%的SpRYgests实现了接近完全的底物切割，其效率大大高于WT SpCas9或SpG。

接着，研究人员将SpRY与REs的另一种替代品:DNA引导的原核Argonaute (Ago)蛋白进行了比较，尽管进行了金属离子和酶剂量优化，TtAgo只能使五种底物中的一种完全裂解，研究人员测试TtAgo与两个阳性对照位点以及最初用SpRY检测的20个位点(其中19/20导致接近完全切割)。在20个位点中都没有观察到DNA切割的证据，说明至少在目前的优化条件下，TtAgo不能在体外像SpRY一样有效地生成DSB。

为了评估SpRYgests在分子克隆应用中的实用价值，研究人员先将DNA底物的裂解反应从纳克(ng)扩大到微克(µg)，从大肠杆菌中过表达并纯化了SpRY，使用三个不同的gRNAs靶向位点，包括NAT, NCA和NGG PAMs，跨越9个不同的温度。发现37°C的反应对SpRY是最佳的。使用纯化的SpRY对这三种gRNAs的切割效率与我们之前使用人类细胞裂解液中的SpRY的结果一致。接着研究人员探索了SpRYgests在没有限制性位点的情况下常规克隆应用程序的潜力，通过单次和双次SpRYgest成功将P2A-EGFP序列添加到SaCas9-ABE8e和PE2的质粒上，在分别组装测序的30个克隆中，有26个和27个是正确的。

研究人员检测了SpRYgests的脱靶切割。发现在克隆SaCas9-ABE8e-P2A-EGFP质粒时，观察到极低水平的次生产物可能是由脱靶DSB引起的。但弱脱靶切割对预期的切割只有很小的影响，不太可能影响纯化的线性片段的克隆。和SpRY- HF1的比较显示，在某些情况下，SpRY- HF1可以减少体外脱靶切割。此外，SpRYgests的另一个潜在应用是使用SpRYgests进行饱和突变，研究人员利用SpRYgests对 SpCas9的催化活性和PAM偏好性至关重要的两个区域进行突变，生成两个饱和突变库，研究SpCas9的生物学特性。

最后，研究人员优化了SpRYgests的各个方面，包括gRNA生产，大大减少了操作时间，通过缩小gRNA反应的规模降低了成本，并使SpRYgest的工作流程更类似于其他分子克隆实验。SpRYgests在DNA底物的特定位置生成DSB的灵活性有望简化、加速和提高分子应用的精准度，这是使用限制性核酸内切酶时是很难实现的。

全文链接：

https://www.nature.com/articles/s41587-022-01492-y

原文链接：

https://doi.org/10.3390/cells11193045

转自：“植物生物技术Pbj”微信公众号

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