NBT | 一种识别转录因子结合位点适应性效应的竞争性精确CRISPR方法

目前的基因组编辑工具，如CRISPR-Cas9，已被证明是许多序列编辑的有力工具。同源定向重组(HDR)介导的精确编辑可以精确地在预期的位点引入基因改变，但这种方法存在DNA损伤反应强、效率低和与CRISPR文库筛选方法不兼容的问题。由于精确基因编辑的效率较低，混合筛选通常使用慢病毒介导guide RNAs文库到细胞系，这些方法不能精确到单碱基或单等位基因，它们的精度是有限的。

近日来自芬兰的赫尔辛基大学的Teemu Kivioja团队和Jussi Taipale团队在国际知名期刊Nature Biotechnology杂志上在线发表了名为A competitive precision CRISPR method to identify the fitness effects of transcription factor binding sites的研究论文，该团队描述了一种竞争性基因编辑方法，该方法基于精确的CRISPR基因编辑，使用具有原始序列或改变序列的模板库和序列标签，可以在原始细胞和突变细胞之间进行直接比较，该团队使用具有竞争力的精确基因编辑（a competitive precision genome editing，CGE）方法来解剖基因MYC下游的转录网络。

MYC是一种基本的螺旋-环-螺旋(bHLH)TF，它与另一bHLH蛋白MAX形成异二聚体，并通过与含有E-box (CACGTG)基元的调控元件结合来调控大量的靶基因。MYC对胚胎发育是不可或缺的，但在正常细胞中，它的表达受到严格控制。然而，由于MYC的靶点数量众多，确定MYC的直接转录靶点一直具有挑战性。该团队推测，解剖MYC下游基因调控网络最有效的方法是通过突变其调控区域的MYC结合位点来单独评估每个目标基因的作用，该团队确定了MYC重要的转录靶点，并表明MYC靶基因启动子的E-box突变降低了细胞适应性。

CGE方法使用CRISPR-Cas9技术与HDR模板库结合，带有序列标签，可对目标细胞群进行谱系追踪。HDR模板包含两种类型的突变:一种是针对感兴趣的基因组特征的实验性突变，另一种是引入可变序列标记的沉默或接近沉默突变。CGE方法的一个关键设计特征是使用至少两个实验变量。其中一种(对照)通过保留原始基因组序列来重建感兴趣区域的野生型序列，而另一种则用所需的突变序列替换它，如非功能性TF结合位点。

该团队报告了一种测量精确靶向突变表型效应的先进方法。该方法允许控制DNA损伤的影响，这是基于CRISPR方法的主要混淆因素。研究人员还通过稳健地检测单个TF结合序列和单个氨基酸替代的小适应性效应，展示了该技术的强大之处。该方法具有广泛的适用性，并扩展了CRISPR–Cas9介导的基因组编辑的应用，以解决使用现有技术难以解决的重要生物学问题。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41587-022-01444-6

转自：“植物生物技术Pbj”微信公众号

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