Plant Communications | 紧凑型CRISPR-Cas12j2植物基因组敲除编辑活性评价及定向表达调控系统开发

近日，Plant Communications在线发表了电子科技大学张勇教授、马里兰大学Yiping Qi博士课题组合作完成的：“Hypercompact CRISPR-Cas12j2 (CasΦ) enables genome editing, gene activation, and epigenome editing in plants”论文。该文基于V-J型CRISPR-Cas基因簇成员CRISPR-Cas12j2核酸酶系统，测试了其在植物基因组敲除编辑中的可行性，进而实现了紧凑型CRISPR-Cas12j2植物基因组定向转录激活及DNA甲基化表观编辑系统在植物中的应用，进一步丰富了植物基因组编辑工具箱。

尽管CRISPR-Cas9、Cas12a核酸酶已被广泛应用于动、植物及微生物基因功能解析、新种质创制工作中，但现有的Cas9、Cas12a核酸酶尺寸较大 （>1000 aa） ，影响了基因组编辑系统的递送效率。同时，相较于自然界丰富的CRISPR-Cas基因簇分子资源，目前鉴定的CRISPR-Cas成员相当有限。进一步挖掘CRISPR-Cas新成员，构建紧凑、高效、精准、应用范围广的基因组编辑新系统一直是研究者努力的重要方向。2020年，研究者报道了存在于巨大噬菌体中的V-J型CRISPR-CasФ核酸酶，该酶具有蛋白尺寸小 （700-800aa）、PAM识别宽松（TBN）的特点，显示了作为基因组编辑工具的潜在应用价值（Pausch et al., 2020）。

电子科技大学张勇教授、马里兰大学Yiping Qi博士课题组基于此前开发的高效RZ核酸酶及双Pol II驱动CRISPR-Cas系统（Tang et al., 2016, Molecular Plant; Tang et al., 2017, Nature Plants; Zhang et al.,2021, Nature Communications），开发了多类型Cas12j2植物基因组编辑新系统，对其基因组敲除编辑效率、PAM位点偏好、编辑特异性进行了评价，进而实现了基于Cas12j2系统的植物基因组定向转录激活及DNA甲基化表观编辑。主要研究结果简述如下：

1、 基于RZ核酸酶及双Pol II驱动策略，构建了Cas12j2植物基因组编辑敲除骨架载体（图1A），结合“原生质体瞬时转化+扩增子通量测序”策略，以水稻、番茄为模式材料，对Cas12j2植物基因组敲除效率、PAM位点偏好性、编辑特异性等进行了测试。结果表明：1）Cas12j2敲除编辑工具在水稻原生质体TTV（V：A、C、G） PAM位点处具明显编辑活性（图1B-1D）；2）基于Cas12j2核酸酶可以在水稻、番茄中实现多位点共编辑（图1F-J）；3）Cas12j2核酸酶在植物细胞中主要产生PAM远端13-24bp区间3-17bp的多碱基删除（图1K-1N）；4）Cas12j2核酸酶编辑表达载体中，crRNA长度逐渐截短会显著降低编辑活性，当crRNA长度为14bp时，无明显编辑活性可检测（图1O）；5）PAM近端crRNA错配可显著抑制Cas12j2核酸酶敲除编辑活性，而PAM远端crRNA错配对其敲除编辑活性影响有限（图1P），显示了Cas12j2核酸酶系统的保真、精准编辑特性；6）基于nCas12j2核酸酶变体，进一步提升了Cas12j2核酸酶敲除编辑活性（图1Q）。

2、 通过将Cas12j2核酸酶与6TAL-VP128激活结构域（TV）偶联表达，构建转录激活系统（图2A），使用截短的crRNA，在水稻原生质体瞬时转化及稳定转化再生植株中均实现了对内源靶基因的有效定向转录激活（图2C-2G）。

3、 基于Cas12j2核酸酶与甲基化酶催化结构域偶联表达策略，构建了紧凑型CRISPR-Cas12j2新型植物基因组DNA甲基化表观编辑器（图3A），针对水稻内源基因OsGBSS1启动子区域，有效实现了CG、CHG、CHH单元的5mC甲基化修饰上调，并抑制了OsGBSS1的转录水平（图3B-3D）。

电子科技大学生命科学与技术学院博士生刘诗诗、范婷婷及马里兰大学植物科学与风景园林系博士生Simon Sretenovic为论文共同第一作者，电子科技大学张勇教授、马里兰大学Yiping Qi博士为共同通讯作者，表观编辑器活性评价工作得到了中国农业科学院生物技术研究所谷晓峰研究员课题组的帮助。研究工作得到了国家科技重大专项、国家自然科学基金、四川省创新人才等项目的资助。

论文链接：

https://www.cell.com/plant-communications/fulltext/S2590-3462(22)00290-5

转自：“植物生物技术Pbj”微信公众号

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