Nature Methods | 南方科技大学陈曦/靳文菲合作开发单细胞多组学技术

随着技术发展，已经开发出能够在单细胞水平上对各种模式进行详细表征的方法，例如基因表达、染色质可及性和蛋白质丰度。来自同一单个细胞的染色质可及性和基因表达的联合分析提供了有关动态过程中组织中细胞类型和细胞状态的关键信息。

2022年9月15日，南方科技大学陈曦和靳文菲共同通讯在Nature Methods 在线发表题为“ISSAAC-seq enables sensitive and flexible multimodal profiling of chromatin accessibility and gene expression in single cells”的研究论文，该研究开发了一种高度敏感和灵活的单细胞多组学方法ISSAAC-seq (in situ SHERRY after ATAC-seq)，用于在同一个单核中检测染色质可及性和基因表达。该方法操作灵活，既适用于基于孔板的低通量实验方案，又可以通过微流控装置进行高通量研究。

来自不同模式的数据提供了关于细胞类型或状态的独特和互补的信息。然而目前，大多数方法一次只检测一种细胞形态。尽管信息量很大，但仅对细胞的一个分子层进行了分析，这不足以提供细胞状态或相关监管程序的全面视图。某些计算方法允许在下游分析期间整合不同的分子层，但这种整合的表现很难评估。此外，许多集成方法都基于来自不同模式的数据可以投影到一些共享的潜在空间这一假设，这仍有待严格测试。因此，为了规避这些限制，人们不断开发新的方法来并行检测来自同一单细胞的不同分子层。在这项研究中，研究人员开发的ISSAAC-seq技术，以利用原位测序检测异源 RNA-DNA-hybrid。其原理基于最近开发的Sequencing HEteRo RNA-DNA-hYbrid (SHERRY) RNA-seq和陈曦团队此前发表的scATAC-seq方法。实验设计在细胞原位通过两轮差异化的Tn5转座反应，分别标记ATAC-seq和RNA-seq序列,混合扩增建库后测序。ISSAAC-seq实验基本流程为：分离细胞核->开放染色质标记->原位逆转录->原位标记DNA/RNA杂合链->酶切缺口补齐及单链DNA消化->单细胞分选->文库扩增。由于在RNA原位逆转录时使用了含有TruSeq adapter序列的特异逆转录引物，使得以TruSeq adapter序列为index，可将RNA-seq数据与ATAC-seq数据分离，进行后续数据分析。

ISSAAC-seq的优点在于：

避免了同类方法中的多次细胞混合和分离过程，无需index片段连接，简化了实验流程，提高了建库效率，并得到更高的数据质量；

其模块化的设计使得操作十分灵活，分为原位反应模块以及单细胞分选模块。在原位反应模块中，所有的化学反应均在群体水平的细胞核内完成。随后，研究人员可根据自身课题需要、现有仪器设备等因素，自行决定单细胞分选的方法。

对于单细胞分选步骤，既可以通过孔板进行小量的测试或者对稀有样品的解析，也可以采用微流控装置进行大量的单细胞测序。其中凡是带有Nextera TruSeq Read 1序列的平台，均可使用微流控装置。不仅如此，研究人员还测试了基于10x Genomics Single Cell ATAC平台或基于多孔板流式分选平台，结果显示ISSAAC-seq均能在单细胞中测得大于10,000 ATAC unique reads in peaks和2000-5000个基因表达。其数据质量与10x Genomics Multiome试剂盒相近，远高于已发表的其他开源方法，但成本仅为10x Genomics Multiome试剂盒的一半或更低。ISSAAC-seq 是敏感的，并且可以提供比现有方法多数量级的高质量数据。利用这一技术，研究人员分析了来自小鼠大脑皮层的 10,000 多个细胞核的关节图谱，发现了主要和罕见的细胞类型和细胞类型特异性调控元件，并在由基因表达定义的已建立细胞类型内确定了染色质水平的异质性。最后，进一步揭示了在少突胶质细胞成熟轨迹期间基因表达和染色质可及性的不同动态和关系。总的来说，ISSAAC-seq的高度可重复性、模块化设计和低成本的小规模预实验模式也为这一技术在方法学上的进一步拓展提供了可能。该论文的共同第一作者为南方科技大学生命科学学院徐玮和杨伟龙，助理教授陈曦和靳文菲副教授为本文的共同通讯作者。此方法也得到了宋昆副教授和洪旎研究助理教授的帮助。陈雅文、张云龙等同学也参与了该项工作。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41592-022-01601-4

转自：“iNature”微信公众号

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