2022年9月13日，中国农业大学生物学院陈其军团队在国际学术期刊Molecular Plant在线发表了题为“Optimized prime editing efficiently generates glyphosate-resistant rice plants carrying homozygous TAP-IVS mutation in EPSPS”的论文。该论文从多个方面优化了引导编辑技术，大幅提高了引导编辑器在水稻中的效率，并利用优化的引导编辑器高效诱导了EPSPS基因产生纯合TAP-IVS突变，为水稻非转基因草甘膦抗性育种奠定了坚实的基础。
https://doi.org/10.1016/j.molp.2022.09.006
引导编辑技术是一种基于CRISPR/Cas系统的通用型精准基因组编辑技术[1]，在植物基础研究和作物分子育种中应用潜力巨大。但由于第一代引导编辑技术在植物中的效率偏低，限制了该技术在植物中的应用。最近，哈佛大学的David Liu团队通过3种优化策略在哺乳动物细胞中大幅提高了引导编辑效率[2,3]，包括：（1）在pegRNAs的3’端引入evopreQ1等假节RNA结构提高pegRNAs的稳定性，命名为epegRNAs;（2）优化PE2蛋白，得到PEmax;（3）抑制细胞中DNA错配修复途径（MMR）。为克服引导编辑在植物中应用的障碍，陈其军研究团队在水稻中测试了基于这3种策略改进的引导编辑器。
草甘膦是一种常用的低毒除草剂，抗草甘膦的转基因大豆等在商业上获得了巨大的成功。通过基因组编辑技术培育无转基因成分的抗草甘膦作物品种具有良好的应用前景。EPSPS基因的TAP-IVS突变是在绿穗苋自然变异群体中发现的抗草甘膦突变，不同于TP-IS（TAP-IAS）突变导致的纯合致死或严重的适应性代价，该突变可以纯合，且没有明显的适应性代价[4]。因此，将天然存在的TAP-IVS突变引入水稻有望培育无转基因成分的草甘膦抗性种质。
为此，研究人员首先在水稻原生质体中对EPSPS基因TAP位点进行了引导编辑测试。结果表明，优化后的引导编辑器显著提高了TAP-IVS编辑效率【图1A】。在稳定转化株系中，优化的引导编辑器（ePE3max和ePE5max）可高效产生纯合和杂合的TAP-IVS突变株系【图1B-D】。草甘膦抗性测试表明，纯合的TAP-IVS突变体可以耐受10 mM的农用草甘膦喷施处理【图1E】。这些结果为水稻非转基因草甘膦抗性育种奠定了坚实的基础。
与该团队之前研究结果一致[5]，研究人员发现除Indels外还存在两类主要的副产物【图1A, D, F】：由DNA异源双链的均衡修复衍生的副产物（Re-byproducts）及源自pegRNA支架的副产物（Sc-byproducts），并在文中提出了降低各类副产物的方法或建议。
为进一步验证ePEmax系统的高效性，研究人员对更多的靶点进行了测试。对六种引导编辑器在20个靶点中的编辑效率进行比较分析，结果显示，与TAP位点的编辑结果一致，epegRNAs和PEmax均可以显著提高PE编辑效率，且二者联合使用时具有加和效应。这些结果提示，优化的引导编辑器在水稻中的编辑效率可以达到实用化程度【图2A, B】。随着编辑效率的提高，优化的编辑器也诱导产生了更多衍生于pegRNA支架的副产物，在之前的研究中他们曾提出设计pegRNA的终止规则[5]：将对应于RT模板的基因组DNA与pegRNA支架3’端相同的几个核苷酸（如C, GC, TGC）作为设计RT模板的终止信号。在原生质体中测试发现，根据终止规则重新设计的编辑器的确可以有效去除此类副产物【图2C, D】。
不同于之前的研究报告[6]，该研究发现PE3系统编辑效率要显著高于PE2系统。为解释这种不一致的现象，研究人员提出了两种可能的原因，即表达pegRNA的启动子不同及选择合适的nicking sgRNAs是确保PE3编辑效率优于PE2的关键。研究人员在原生质体中验证了这两种理论解释。结果表明，使用复合型启动子35S-CmYLCV-U6（35C）与U3相比的确具有更高的编辑效率；与U3相比，当使用35C时，PE3的编辑效率与PE2相比有更大的改进【图3A】；PE3对编辑效率的增强作用取决于nicking sgRNAs的活性和位置【图3B】。针对四个靶点的四种引导编辑器在转基因株系中的测试结果进一步证明了植物中PE3系统编辑效率要高于PE2系统【图3C】。此外，该研究发现在某些靶点通过共表达MLH1的显性负调控突变体（OsMLH1dn）抑制MMR，可以提高引导编辑效率以及降低PE3系统的Indel副产物，表明OsMLH1dn至少在某些靶点中能够发挥预期的作用【图3C】。
综上，该研究表明经过优化的PEmax和epegRNAs可以大幅提高植物引导编辑器的效率，OsMLH1dn在一些靶点中可以与PEmax和epegRNAs协同作用，优化的引导编辑器在水稻中的编辑效率达到实用化程度。该研究也表明利用终止规则设计pegRNAs的RT模板可以有效降低衍生于pegRNA支架的副产物。该研究利用优化的引导编辑技术高效诱导了EPSPS基因的纯合和杂合TAP-IVS突变，为水稻的非转基因草甘膦抗性育种奠定了坚实的基础。
论文第一作者是中国农业大学生物学院博士生姜媛媛和柴一萍，这是她们继2020年在Genome Biol合作发表引导编辑论文后合作发表的第2篇引导编辑论文，在引导编辑技术研发上积累了丰富的经验。通讯作者是中国农业大学生物学院陈其军教授。河南大学生命科学学院周云教授及中国农业大学生物学院王学臣教授也参与了论文研究工作。论文研究得到国家自然科学基金及重点研发项目的资助。水稻遗传转化得到中国农业科学院作科所吴传银研究员和隋毅副研究员的帮助。
论文的收稿日期为3月22号，接受日期为9月8号，从投稿到接受历经五个多月。论文初稿主要在两个方面受到审稿人的严格审查：OsMLH1dn的有效性以及PE3优于PE2这一结论与之前研究结论不一致问题。通过补充20个载体的转基因数据及两组原生质体数据，修改稿回答了审稿人的关切。值得注意的是，在论文审稿期间，有多个课题组陆续发表了优化的引导编辑器，包括：中国科研院遗传与发育研究所高彩霞课题组发表在Nat Biotech上的论文，中国农业科学院作科所夏兰琴课题组发表在Mol Plant上的论文，安徽农业大学魏鹏程课题组发表在Genome Biol上的论文，以及中国农业科学院水稻所王克剑课题组和中国科研院遗传与发育研究所李家洋课题组合作发表在Sci China Life Sci上的论文。除夏兰琴课题组是基于代理编辑策略优化引导编辑外，其他课题组均指出，使用epegRNAs大幅提高了引导编辑效率，与陈其军课题组的研究结论一致。此外，魏鹏程课题组还测试了PEmax蛋白及MLH1dn。令人感兴趣的是，魏鹏程课题组的研究结果指出，使用35S-CmYLCV-U6复合启动子表达epegRNAs对引导编辑效率有明显的增强作用，这也与陈其军课题组的结论一致。陈其军课题组开发的引导编辑器是基于pGreen3三元载体系统，这是在编辑试剂递送方面不同于其他课题组的地方，感兴趣的用户在使用这套优化的编辑器时需要留意这个区别。总之，引导编辑在各种作物中效率低、达不到实用化程度的缺陷正在或已经得到克服，未来基于引导编辑的精准基因组编辑技术在作物育种及基础理论研究中的应用将会大放异彩。
转自：“iPlants”微信公众号
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