Mol Plant | 墨西哥科学家揭示拟南芥雌蕊发育过程中的蛋白互作全景图

2022年9月9日，墨西哥瓜纳华托的Stefan de Folter科研团队在国际著名期刊Molecular Plant发表题为“The protein-protein interaction landscape of transcription factors during gynoecium development in Arabidopsis”的研究论文。本研究通过使用系统生物学方法绘制特征明确的转录因子之间的相互作用来了解复杂生殖单元（如雌蕊）的形成过程。

https://doi.org/10.1016/j.molp.2022.09.004

研究显示，拟南芥花器官的形成需要MADS-box转录因子（TF）发挥作用。在分子水平上，MADS-box转录因子（TFs）通过蛋白-蛋白相互作用（PPIs），并形成蛋白复合物来调控靶基因的转录。雌蕊是花的雌性生殖器官，对果实和种子的产生至关重要。目前已经确定了一些TFs可以调节雌蕊的发育。但目前的信息还远远不够全面，TF之间的相互作用及其如何参与雌蕊的发育过程仍然知之甚少。

目前已知超过80种转录因子（TFs）在雌蕊发育过程中发挥作用，并且大部分通过蛋白-蛋白相互作用（PPIs）。为了鉴定这些PPIs，本研究首先使用拟南芥蛋白编码的开放阅读框（ORF）进行了依赖于酵母双杂交（Y2H）系统的高密度矩阵分析（图1B）。研究者筛选了雌蕊发育相关的转录因子，显示82个蛋白分属于17个TF家族，例如Homobox、Zn指、ARF、ARR、bHLH、AP2和MADS-box家族等（图1C）。在雌蕊发育过程中蛋白表达谱表明，许多TFs可以在雌蕊中相互作用(图1D)。本实验在369种组合中检测了酵母菌的生长，并基于得分最高的相互作用构建的蛋白质-蛋白质相互作用网络(GYN-NET-TF)(图1)。

研究者接下来想知道是否可以根据上述TFs的功能进行分组。本研究选择了已经完成了功能鉴定的82个TF，并对突变体的表型信息进行了整理。在雌蕊发育的不同时期，可观察到突变体不同的缺陷：例如心皮数的改变；背面-正面或顶端-基底模式改变；隔膜、胚珠或瓣膜边缘缺陷等。利用这一信息生成了参与相同发育过程的互作蛋白的功能网络：GYN-NET-TFfheno。然而，由于不是所有的组织都同时发育，蛋白相互作用可能并不一致。突变体在不同发育阶段都可以观察到缺陷（图2，图3A）。研究者使用蛋白编码基因的表达数据来解决时间问题，创建了时空PPI网络，将其命名为GYN-NET-TFtempo（图3）。

为了获得生物学相关PPI网络的进一步支持，研究者分析了基于功能相关的网络和空间时间网络，将功能过程与时空环境关联起来，命名为：GYN-NET-TFPHENO+TEMPO。在GYN-NET-TFPHENO+TEMPO中共有128个子网。这些子网在图3A中以点的形式表示，其中最上面一行表示14个时空背景(区域a到N)，深蓝色的点表示该区域中每个完整网络的大小。相关的亚网络可以根据不同的发育阶段发挥作用。因此，当跟踪发育过程时，即沿着雌蕊形成的分支，从雌蕊原基到最后的组织，可以获得连续的网络(图3B)。图3C-F显示了心皮数目、背面-正面模式、 胚座框发育、雌蕊传导管等网络序列。当合并35个可能相关的GYN-NET-TFPHENO+TEMPO亚网络时，可以观察到51个蛋白质和119种相互作用（图3G）。并通过计算每个二聚体被发现的次数，以分析每个相互作用对雌蕊整体发育的影响。观察发现，在前10个互作最“频繁”的二聚体中，由bHLH转录因子(HEC1, HEC2, HEC3, SPT)形成的二聚体出现的概率最高;此外，二聚体SEU-LUG也频繁出现(图3H)。

研究者接下来检测了一些植物激素相关转录因子的互作。分析显示，6个TFs：HEC2、WUS、IND、CRC、BP、AS1可以与生长素和细胞分裂素两种信号通路的调节因子发生相互作用。通过对生长素或细胞分裂素(分别为DR5或TCS标记)的转录反应可以看出，激素反应在雌蕊发育过程中位于不同的位置(图4)。尽管生长素和细胞分裂素具有互补(或相反)的反应区，但这些激素的转录反应在某些区域重叠，如花柱和胚珠的某些区域(图4)。可以推测，在雌蕊发育过程中，蛋白质复合物的组成可能会随着激素在特定组织中的分布或发育时间而改变。

PPI网络包括了大多数控制雌蕊发育的TFs(82个蛋白质的编码基因，GYN集合)。随着本研究鉴定的68个蛋白之间的263种相互作用的加入(图5)，生成了一个扩展的PPI网络，并获得了指导雌蕊发育的TFs互作的完整视图(图5)。这个扩展网络包括32个转录因子以及810个互作。这些转录因子主要富集于bHLH、Homeobox、AP2/ERF、myc型、亮氨酸拉链结构域和TCPs家族。根据蛋白互作的数量，扩展的网络包括三种类型的节点。在外围，76%的交互集中在三个节点:ARF19、WOX13和TCP15。接下来，有2-4个交互的节点。最后，在核心附近至少有5个节点进行交互，这些高度连接的节点可以很好地形成互作组分析(图5)。有趣的是，这些高度连接的蛋白中有10个属于TCP转录因子家族（图 5）。总之，该扩展网络的构建为200多个TF的重点功能研究铺平了道路。

在扩展的PPI网络中，筛选到与雌蕊TFs互作的蛋白IAA27。IAA27属于AUX/IAA蛋白，之前未被报道过与拟南芥雌蕊发育有关。研究者首先通过酵母双杂交以及BiFC实验证实了与预测蛋白ARF8、ARF19之间的互作。随后，对获得的敲除突变体anti-IAA27进行了功能分析。与野生型相比，anti-IAA27植株的花序产生的花蕾较少，花器官呈淡黄色，花药较短，成熟花粉粒较少，种子数量减少等。进一步分析显示：胚珠形态存在缺陷，主要是胚囊发育停滞引起的（图6）。横切面结果显示，anti-IAA27植株的花药产生的花粉粒也比野生型少。最后，使用LAT52：：GUS报告基因来观察花粉管的生长情况，显示anti-IAA27植株中花粉管的生长受到了影响（图6）。另外一个候选基因ARR14，参与细胞分裂素信号转导。根据本研究酵母双杂交高密度矩阵分析筛选到与ARR14互作的28个蛋白。GUS报告基因显示该基因在花发育过程中具有广泛的表达(图6)。尤其是雌蕊的柱头和花柱中有强烈的表达。突变体分析显示，arr14-2有一个突出的柱头，受精后，乳突显示出延迟衰老，直到果实发育的第17阶段。在arr14-3中，植株表现出初生枝伸长异常，主花序花梗伸长改变等。总之，扩展的PPI网络可以识别雌蕊发育中的其他蛋白，并为未来的研究提供资源。

综上所述，本研究提出了一个拟南芥雌蕊发育的全面的PPI网络。本项工作与人工筛选的表达数据和功能信息相结合，提取时空网络和亚网络，在雌蕊发育过程中指导组织形成。这些网络反映了TFs中PPIs的预期动态，TF的功能特征证明了它的价值。总之，所生成的PPI网络和数据分析建立了一个全面的雌蕊基因调控网络，并为理解TFs在植物生殖过程中的作用提供有价值的资源。

本文转载自Mol Plant植物科学

转自：“植物生物技术Pbj”微信公众号

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