众所周知，CRISPR-Cas 技术早已成为生命科学领域应用最广泛的技术之一，目前基于 CRISPR-Cas 的基因编辑技术已广泛应用于基因校正，遗传育种等各领域。
目前大家所使用的 CRISPR-Cas 技术都是基于 CRISPR 系统的精准靶向和 sgRNA 介导的核酸酶酶展开的。如果能找到一种 sgRNA 介导的蛋白酶，那将是生物医疗史上新的一页。
北京时间 2022 年 8 月 26 日凌晨 2 时，美国康奈尔大学可爱龙实验室联合荷兰代尔夫特理工大学 Stan J.J Brouns 实验室，在 Science 杂志以长文形式发表了题为 Craspase is a CRISPR RNA-guided, RNA activated protease 的研究论文。
该论文报道了 Craspase（CRISPR 偶联的蛋白酶新系统，CRISPR associated Caspase）是一个 gRNA 引导靶向，并且受到靶向 RNA 激活的蛋白酶，该蛋白酶受到激活之后可以对天然的蛋白底物进行切割并诱导细胞死亡。在精准医疗新时代背景下，该工具有望引领出全新的精准医疗思路。
最近几年，得益于基因库的爆炸性增长，越来越多的 CRISPR-Cas 相关的新系统被发现【1】。比如最近两年检索出一种全新的系统 type III-E。该系统拥有四个 Cas7、一个 Cas11 以及一个功能位置的 insertion 结构域。然而在该系统中，这些原本属于独立亚基的组分全部串联成为一个氨基酸长链，成为单亚基模式。
该系统的 CRISPR 相关蛋白被命名为 Cas7-11， 也有一个好听的名字：gRAMP (「重复序列相关的巨大的神奇蛋白」, Giant Repeat Associated Mysterious Protein）。该蛋白被证实拥有 RNA 靶向能力，并在真核细胞内已展现出应用价值【2-4】。这个系统最大的亮点，是其 CRISPR-Cas 系统附近的蛋白酶 TPR-CHAT，前期的研究表明，这个蛋白酶可以与 CRISPR 系统形成一个复合物【4】。然而之前还没有找到该系统的蛋白酶活性，或者说还不清楚是靠什么机制去激活该蛋白酶。
美国康奈尔大学可爱龙教授团队胡纯一博士借助冷冻电镜，首先解析了巨大神奇蛋白 gRAMP 的结构，可以区分出四个序列完全不同的 Cas7.1, Cas7.2，Cas7.3, Cas7.4，以及一个 Cas11 和一个 insertion 结构域。比较有意思的是，这个系统的 guide RNA 5' 端具有比其他 type III 长的多的 handle，长度达到了 14～20 个碱基，而其他 Type III 类型只有 8 个碱基【5】。此外，该系统 guide RNA 的 handle 区域，前两位（-1 和-2）碱基是暴露出来的，可以用于碱基配对，该部分序列被成为 PFS 区域（protospacer flanking sequence）。见图一。
后续，胡纯一博士等人，继续对 Craspase 进行了全方位的解析，通过结构比对，发现 Craspase 只有在结合 non-matching PFS 的 RNA 底物时才会发生巨大的构象变化，该类 RNA 底物可以通过 non-matching 的 PFS 的介导靶向 RNA 的 3' 端与开关螺旋 switch heliex 发生空间冲突，这会刺激这个开关螺旋进行重排和位移，而这种构象改变会以一种接力的方式最后引起蛋白酶活性中心的激活（图二）。
通过原子分辨率的结构比较，团队发现和静息状态比，靶向「non-matching」非我序列 RNA 之后，蛋白酶活性催化二联体组氨酸-半胱氨酸的距离从 6.6 埃缩小到 3.3 埃，从而可以实现对蛋白多肽链的攻击（Movie 1）。
最后一个关键问题，这个蛋白酶的底物是什么？团队通过体内体外筛选，成功筛选到该 Craspase 系统蛋白酶底物，名为 Csx30。该 Craspase 系统唯有在结合了「非我」RNA 之后能快速特异性地对该蛋白底物进行切割。因此这个结果从生化水平非常确切地验证了该蛋白酶系统受到 CRISPR 系统的精准调控，最后成为靶向 RNA 激活的蛋白酶。此外，该团队还从结构出发，设计出了一些多肽序列，在体外也能在靶向 RNA 激活的情况下实现蛋白酶的精准切割。这在一定程度上暗示了该系统非常有潜力成为蛋白定向降解的新工具（图三），前景十分广大。
CRISPR-Cas 系统首先使用 Cas1-Cas2 从噬菌体内摄取 DNA 片段整合进入自己的 CRISPR 区，形成 spacer【6】。CRISPR 区转录成为 crRNA 被加工成为 guide RNA。Cas 蛋白利用 guide RNA 对噬菌体进行精准靶向和消灭【7】。简言之，CRISPR-Cas 系统的初衷实际上就是原核生物一种获得性免疫系统，最终都是用来对抗外来侵略的。因此最后一个终极问题，这个蛋白酶与免疫功能是否相关？
关于这个问题，在 8 月 18 日和 8 月 22 日，bioRxiv 预印本网站上，分别上传的日本东京大学 Hiroshi Nishimasu、美国麻省理工大学 Jonathan S. Gootenberg 团队合作题为 RNA-triggered protein cleavage and cell death by the RNA-guided type III-E CRISPR-Cas nuclease-protease complex，以及北京化工大学冯越教授与清华大学杨茂军教授合作题为 Structural and functional insights into the type III-E CRISPR-Cas immunity 的两篇重量级论文（如下图），分别在 Desulfonema ishimotonii 和 Candidatus "Scalindua brodae"（与本篇 Science 论文使用了同一物种）物种中都观察到了一致的现象。在 PFS non-matching 的 RNA 靶向之后，都会激活 Caspase-like 蛋白酶并切割蛋白底物 Csx30。并且这两篇论文都同时明确证实了 Csx30 在受到 Craspase 蛋白酶切割之后会诱导细胞死亡。因此这确切的证明这个蛋白酶的确是用来防御噬菌体师兄 abortive infection。
总之，这篇 Science 论文，全面阐述了 Craspase 系统是如何通过 guide RNA 引导，并且受到靶向 RNA 激活的蛋白酶活性的详细机制，该蛋白激活之后会切割蛋白底物，诱导细胞死亡，因此该项工具在未来有可能作为新的精准医疗工具。此外，若在蛋白酶特异性上进化出更加多样性，有望翻开蛋白定向降解的新篇章。
相关论文信息：
Doi:10.1126/science.add5064
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