NBT | 大幅提高敲入效率和产量的新方法！

2022年8月25日，《自然生物技术》杂志在线发表了美国Gladstone-UCSF基因组免疫学研究所Marson教授实验室在基因编辑方面的最新成果High-yield genome engineering in primary cells using a hybrid ssDNA repair template and small-molecule cocktails：作者开发了单链 DNA (ssDNA) 同源定向修复（HDR）模板，它结合了毒性降低的Cas9 靶序列（CTS），相对于 dsDNA CTS，敲入效率和产量平均提高了约两到三倍。

CRISPR–Cas9 基因组编辑的人类细胞疗法最近已进入临床。基于 Cas9 的 T 细胞和造血干细胞 (HSC) 敲除是目前很有希望的一项技术，其安全性也有一定的保障。与病毒的非靶向整合或基于转座子的方法相比，Cas9 刺激的 HDR 允许精确靶向基因组变化，从而提高细胞产品的质量、均匀性和安全性。除了降低潜在的整合风险外，靶向基因组编辑还可以消除对人工启动子的需求。

Marson课题组使用 Cas9 和gRNA核糖核蛋白 (RNP) 的电穿孔来生成靶向基因组断裂的方法，对原代人类 T 细胞的体外 CRISPR 基因组编辑进行了广泛优化。为了使用 HDR 引入靶向序列插入或替换，包含了一个 HDR 模板 (HDRT)，该模板编码了位于基因组断裂两侧的同源臂之间所需的遗传变异。几种不同的方法用于引入 HDRT，包括用重组腺相关病毒 (rAAV) 进行病毒转导，或用 dsDNA、ssDNA、裸DNA进行共电穿孔。HDR 的效率和细胞毒性都随 HDRT 的浓度和形式而变化。对于大型结构，基于 rAAV 的方法迄今已实现很高的敲入效率，同时保持最小的毒性。虽然 rAAV 载体得到快速发展，但由于制造这些试剂的成本和难度，研究和临床应用的整合速度已减慢。裸 DNA 的共电穿孔有可能加快基因修饰细胞疗法的创新步伐，因为它的开发成本相对于病毒载体来说很低。非病毒方法已应用于主要人类细胞类型；然而，这项技术还需要进一步改进，以降低 DNA 毒性，提高敲入纯度和细胞产量，并推进临床应用。

作者过去开发了一种通过结合 Cas9 靶序列 (CTS) 来提高 dsDNA HDRT 敲入效率的方法，允许共电穿孔的 RNP 结合 HDRT 并促进它们的传递。这可以显著提高敲入效率，但同时细胞毒性也会增加。通过加入阴离子聚合物如聚谷氨酸 (PGA) 以提高细胞产量，可以减弱但不能消除这种毒性。与 dsDNA 相比，ssDNA 的毒性较小。Cas9 与 dsDNA 靶标结合，因此作者打算建立一种方法，以使基于 CTS 的 HDR 增强适应 ssDNA 模板。

在该篇文章中，作者使用长 ssDNA 开发了一种混合 HDRT，其中 dsDNA 的短区域在每一端都包含 CTS 位点。为简单起见，作者将这些混合 HDRT 称为 ssCTS 模板，并将完全双链版本称为 dsCTS 模板。这篇文章评估了这些 ssCTS 模板在一系列载体大小、基因组位点和临床相关细胞类型上的敲入效率和毒性，包括原代人类 T 细胞亚群、B 细胞、自然杀伤 (NK) 细胞和 CD34+ 细胞。此外，作者评估了一组据报道可增强原代人类 T 细胞中 HDR 的小分子，确定了使用 ssCTS 模板进一步增强 HDR 的最佳组合和浓度。最后，作者调整了方法来生成一个良好生产规范(GMP)兼容的完全非病毒CAR-T细胞生产过程。这项技术有望在原代细胞中模拟患者突变，并在临床规模上灵活地设计细胞疗法。

原文链接：

 https://www.nature.com/articles/s41587-022-01418-8

转自：“植物生物技术Pbj”微信公众号

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