Mol Cell：可爱龙团队研发出高效快速的核酸分子诊断工具 HASTE

北京时间 2022 年 7 月 13 日晚 23 时，美国康奈尔大学可爱龙实验室在《分子细胞》（Molecular Cell）杂志发表基于 type I-A 系统的新机制解析和新应用开发的研究成果。

三国有云「天下大勢，分久必合，合久必分」。自然科学亦如是。

CRISPR-Cas 系统是原核生物一种抵御外来入侵核酸的免疫系统，已被广泛用于真核细胞的基因组编辑。目前基于 CRISPR-Cas 的基因编辑技术已广泛应用于遗传育种、新药开发、疾病治疗、动物模型构建、转录调控以及分子诊断等各领域。被誉为在后基因组时代开创了遗传疾病精准治疗的新时代。

CRISPR-Cas 系统可以按照效应物是多亚基或单亚基分为 Class I 和 Class II（一型和二型）。单亚基效应物的 Class II 家族包括大家常用的 Cas9, Cas12, Cas13 等，因其简单、高效、普适性的特性，其应用早已风靡全世界实验室。如果从分布比例上看，多亚基类型的 Class I 家族才是 CRISPR-Cas 系统的「名门望族」，其占比超过 75%，对比 Cas9，Cas12，Cas13 总和也不过 10% 左右，可谓呈「辗轧之势」。然而 Class I 家族 CRISPR-Cas 系统，因为多亚基特性，其样品的获取，操作的编辑性，功能、机制的研究等都显得相对难度更大，因此该家族的研究和应用一直滞后很多。

不过近些年，Class I 家族引起低脱靶，低毒性，功能更丰富多彩的特性，正逐渐展现出特有的魅力 (1-7)。不过 Class I 家族庞大，成员众多，同时每一亚类可能又展现不同的性质，因此对这一庞大家族的了解也不透彻。

对于 Type I 系统，大家普遍认知的工作机制是 Cascade 首先靶向目标 DNA，形成 full R-loop 之后, 再招募 Cas3 完成对靶标 DNA 的切割和水解。简而言之就是：「分—合—分」机制。然而可爱龙实验室胡纯一博士等人发现 Type I-A 系统一个显著不同于 type I 其他系统的性质：Cas3 与 Cascade 是形成一种内在的复合物，而不依赖于目标 DNA 靶向与否，简言之就是「合-合-合」。（如下图所示）

分分合合与否，固然鲜明。然而 CRISPR 系统最重要的一项性质就是：该系统如何去避免脱靶效应，从而降低非特异性的切割？其他的 Type I 系统利用 Cas3 的招募与否来规避脱靶效应（非特异性的靶向不能招募 Cas3）。因此，Cas3 一直结合在 Cascade 上的 type I-A 系统又是如何去规避这一难点？

胡纯一博士联合瑞士洛桑大学/瑞士联邦理工学院 Henning Stahlberg 实验室倪冬春博士等人，使用冷冻电镜全面解析了 type I-A 系统九种状态下的全景工作机制。这些捕获的工作状态桥段，确切的表面，Cas3 通过与 Cas8 的互作，从而成为 Cascade 的内在一部分，并且 Cas3 通过稳定 Cas8 的 N 端构象，极大的促进了 PAM 识别和 DNA 靶向，该结果表面 Cas3 的内在性是具有积极和重要作用的。

重要的是，他们发现，type I-A Cascade 结合 DNA 形成完全互补配对的 full R-loop 结构之后，通过层层构象变化，最终传递给 Cas3 产生一个巨大的构象改变，暴露核酸酶活性中心，从而开始切割靶向 DNA。而部分结合（非特异性结合）靶标形成的 partial R-loop 结构不能产生这种刺激，Cas3 核酸酶依然保持抑制状态，从而避免脱靶切割（如下图）。

众云「合（和）为贵」，那么这套 type I-A 系统独特的吸引力在哪里？胡纯一博士等人发现，type I-A 内在式的 Cascade-Cas3 复合物在不结合目标 DNA 时，完全没有任何核酸酶性质，而当有正确的靶标出现，激活 Cas3 活性之后，会产生一个附属活性，从而可以对 FQ-ssDNA 探针（荧光-淬灭-单链 DNA 探针）进行切割，产生荧光，因此可以通过荧光的强弱即可判断是否有目标 DNA。团队以此原理，开发了一套高效快速的核酸分子诊断工具，并命名为「HASTE」 (heat-activated streamlined nucleic acid detection platform)。该系统可以在 15 分钟之内，对单分子量级的 DNA 完成检测，效果显著，有着与传统 PCR 一样可靠的精度，却极大缩短了时间和成本（下图）。

有意思的是，该项工作还发现，这个 I-A 系统 Cas3 的解旋酶活性严格依赖温度，温度越高，活性越强。因此可爱龙团队利用 42 度温度刺激，可以开发一套温控基因敲除工具，效率超过 90%。因此，在未来，可以利用该性质，未来可以在病灶通过局部的温度刺激来调控该工具的基因编辑效率，从而最大限度地降低基因编辑工具带来的脱靶效应。

结语：分分合合的性质无关好坏，最后都能抵抗外来侵略（细菌抵抗噬菌体）完成自己种族的延续就是好的系统，type I CRISPR 系统如是，人间亦如是。

相关论文信息：

https://doi.org/10.1016/j.molcel.2022.06.007

转自：“丁香学术”微信公众号

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