王初课题组利用半胱氨酸组学分析揭示铁死亡中蛋白质氧化修饰和蛋白酶体的功能联系

近日，北京大学化学与分子工程学院、北大-清华生命联合中心、北京大学合成与功能生物分子中心王初课题组在Cell death & differentiation 杂志上发表了题为“Quantitative reactive cysteinome profiling reveals a functional link between ferroptosis and proteasome-mediated degradation”的研究文章。在这项工作中，作者利用定量化学蛋白质组学技术，系统性地分析了铁死亡细胞中蛋白质组内半胱氨酸活性的变化，发现并揭示了DJ-1蛋白的第106位半胱氨酸可以作为铁死亡细胞的传感器开关，其上的氧化修饰可以显著激活细胞中的蛋白酶体系统。

铁死亡是一种因细胞内氧化还原失衡造成的细胞死亡。作为铁死亡最明显的标志物，脂质过氧化物的积累与铁催化的芬顿反应相结合，导致活性氧物质（ROS） 剧烈地增加。迄今为止，人们已经探索出了多种与铁死亡相关的氧化还原调节通路。然而，细胞氧化还原系统失衡的冲击是如何决定铁死亡命运的目前还不得而知。半胱氨酸是细胞氧化还原稳态的“中枢”氨基酸，其侧链的巯基可通过自氧化参与细胞内氧化还原的调控，保护细胞组分不受ROS的攻击。目前的研究已表明半胱氨酸在铁死亡中起着重要的作用，比如参与抗氧化物谷胱甘肽，辅酶a的合成；阻止半胱氨酸进入细胞时会导致细胞发生铁死亡，从而诱发严重的胰腺癌。不仅如此，半胱氨酸还可以作为多种酶的催化残基，控制蛋白酶的活性。因此，研究铁死亡过程中功能半胱氨酸组的结构是如何被打乱的，将有助于破译这一复杂的细胞死亡途径。目前已有多种定量化学蛋白质组学策略被用于分析复杂生物系统中的活性和功能性的半胱氨酸。其中isoTOP-ABPP（Eranthie Weerapana et al., Nature. 2010）的方法利用半胱氨酸的反应性碘乙酰胺探针（IAyne）和一对可切割的同位素叠氮生物素定量半胱氨酸自身的反应性，以及对天然蛋白质组中半胱氨酸其他代谢修饰的敏感性。本课题组后续对该方法进行了改进，利用还原二甲基化同位素标记，将原来可以进行两标定量的isoTOP-ABPP，升级为可以进行三标定量的rdTOP-ABPP方法（号外 | 王初课题组发展定量化学蛋白质组学新策略），并成功利用苯胺探针实现了对铁死亡细胞中羰基化修饰蛋白和位点的定量分析（号外 | 王初课题组发展可鉴定铁死亡过程中蛋白羰基化修饰的苯胺探针）。本课题旨在利用化学蛋白质组学策略在铁死亡系统中发现新的基于半胱氨酸传感器开关，并研究其在铁死亡中的重要作用。为了定量比较细胞铁死亡前后受到干扰而活性发生变化的半胱氨酸。作者用三种条件分别处理了细胞，第一组是加入DMSO处理的正常细胞，第二组是加入铁死亡诱导剂RSL3处理的铁死亡细胞，第三组是诱导铁死亡后用铁死亡抑制剂Liproxstatin-1处理的挽救细胞。随后作者用IAyne探针对三组细胞的蛋白质组进行标记，如果半胱氨酸在铁死亡过程中的活性发生变化，则会失去部分的IAyne探针的标记。当该标记在加入铁死亡抑制剂后又恢复到正常水平则说明该半胱氨酸的活性特异性地受到铁死亡过程的干扰。随后作者将标记的半胱氨酸利用rdTOP-ABPP方法进行分析，对正常细胞，铁死亡细胞和挽救细胞中富集的肽段分别用轻、中、重的二甲基化试剂进行同位素标记，随后通过酸解，LC-MS/MS检测和CIMAGE2.0的定量（Gao J et al., J Proteome Res. 2021），分析得到了超过4000个可定量的半胱氨酸活性的信息。通过计算每个半胱氨酸的两个活性变化比值，作者筛选到了在铁死亡过程中20个活性受到显著抑制的半胱氨酸。通过进一步的生物信息学分析，发现这些半胱氨酸所在的蛋白质大多参与细胞氧化物去毒的通路中，并且一些已经被其他研究鉴定为调控铁死亡的蛋白。该基于半胱氨酸功能组学的分析，从整体上揭示了铁死亡中氧化还原系统稳态发生的变化。

在鉴定到的功能半胱氨酸残基中，蛋白/核酸去糖化酶（protein/nucleic acids deglycase, DJ-1）的第106位半胱氨酸在铁死亡细胞中的活性显著降低。DJ-1蛋白是细胞应对氧化应激的重要调节蛋白，其功能异常与神经退行性疾病和癌症的发病密切相关。DJ-1蛋白含有三个半胱氨酸残基，在作者的质谱分析数据中，只有C106位的半胱氨酸的活性发生了显著的变化。考虑到C106是DJ-1蛋白的催化活性氨基酸，作者推测该位点的氧化可能对铁死亡的调控具有重要作用。为了验证这一假设，作者随后利用CRISPR/Cas9技术在HT1080细胞中敲除了DJ-1蛋白，发现DJ-1敲除株对铁死亡诱导剂更加敏感，且细胞内脂质过氧化物水平在敲除DJ-1后显著升高。随后，作者在DJ-1敲除株中重新回补野生型和C106A突变型的DJ-1，发现只有回补野生型DJ-1可以恢复因DJ-1缺失造成的影响，而回补C106A突变型则没有这样的作用。这些实验结果说明了DJ-1可以显著抑制铁死亡的发生，并且其第106位的功能半胱氨酸在这一过程中发挥着重要作用。

接着作者着重研究了DJ-1 中C106半胱氨酸是如何在细胞发生铁死亡中发挥调控作用的。首先作者通过免疫沉淀实验发DJ-1在铁死亡发生后与20S蛋白酶体的相互作用显著降低，且C106是DJ-1与20S蛋白酶体发生相互作用的主要氨基酸位点。观察到该现象后，作者推测DJ-1是否通过控制与蛋白酶体的相互作用来影响蛋白酶体在铁死亡细胞中降解蛋白的功能。实验发现，在铁死亡细胞中蛋白酶体的活性显著升高，而该升高的趋势在过表达野生型DJ-1后恢复到正常水平，而回补C106A突变体则没有类似的效果。最后，作者还发现了干扰蛋白酶体的表达及活性同样会影响铁死亡的进程。以上结果说明DJ-1中C106半胱氨酸在铁死亡后的氧化状态变化阻碍了DJ-1与20S蛋白酶体的相互作用，促进20S蛋白酶体活性的升高，并且启动了蛋白降解的功能。

实验的最后，作者通过质谱方法发现了DJ-1 C106在铁死亡过程中主要发生了磺酰化修饰。通过基于SILAC定量的化学蛋白质组学手段，作者发现发生铁死亡后C106的磺酰化修饰水平是正常状态下的4倍。为了进一步佐证DJ-1 C106上的氧化修饰是导致了蛋白酶体活性变化的原因，作者利用体外的GST-pulldown实验，证明了氧化后的C106破坏了DJ-1与蛋白酶体的相互作用。

总之，本篇文章应用定量化学蛋白质组学rdTOP-ABPP技术，全面完整地评估了在诱导及挽救的铁死亡细胞中半胱氨酸组的功能状态，并且发现DJ-1蛋白质中Cys106在铁死亡中的氧化状态阻碍了其与20S蛋白酶体的相互作用，释放了蛋白酶体的降解活性。该文章揭示了铁死亡和泛素蛋白酶体系统之间的一种全新的功能联系，其所获组学数据有助于半胱氨酸新功能的注释及细胞铁死亡分子机制的阐释，为研究铁死亡这一复杂的生物学过程提供了新的思路。本文的通讯作者为北京大学化学与分子工程学院、北大-清华生命联合中心、北京大学合成与功能生物分子中心的王初教授。其指导的北京大学前沿交叉学科研究院生命联合中心2017级博士研究生王妍坤为本文的第一作者。该工作得到了基金委、北京分子科学国家研究中心、教育部生物有机和分子工程重点实验室。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41418-022-01050-8

文章引用：

DOI：10.1038/s41418-022-01050-8

转自：“生命科学联合中心”微信公众号

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