还原态的氮是氨基酸和核酸的生物合成所必需的1。作为唯一具有固氮作用的酶，固氮酶能够以大气中的N2为原料，生成NH3和H2 2 (图1，左)，但与多数氧化还原酶不同的是，连续的电子传递和底物还原依赖于ATP的水解3。
通常来说，固氮酶由铁蛋白 (FeP, γ2同源二聚体) 和钼铁蛋白 (MoFeP, α2β2异源四聚体)组成 (图1, 右)。ATP水解与电子传递的偶联由FeP介导， FeP与MoFeP形成复合物后，可以通过水解2分子ATP将1个电子转移到MoFeP中3，该过程称为FeP循环；在MoFeP循环中，来自FeP的电子被MoFeP的P-cluster接收并转送给铁钼辅助因子 (iron-molybdenum cofactor, FeMoco), N2在FeMoco中被还原2。ATP依赖的FeP与MoFeP之间的相互作用对于这两个蛋白以及P-cluster与FeMoco之间的电子传递都是必需的，但水解与电子传递之间偶联的具体机制不清。
2022年7月28日，来自加利福尼亚大学圣地亚哥分校的F. Akif Tezcan和Mark A. Herzik Jr.共同通讯，在Science上在线发表了题为Structures of the nitrogenase complex prepared under catalytic turnover conditions的科研论文，通过解析固氮酶在催化转化状态下的冷冻电镜结构，进一步阐明了其工作的机制，并发现非对称性贯穿其功能发挥的多个环节。
MoFeP在发挥功能后会迅速回到静息态，固氮酶复合物结合底物的状态难以维持，即使捕捉到底物结合状态，样品也存在非常大的异质性，这些特性导致对固氮酶作用机制的理解困难重重。本文的研究者在Azotobacter vinelandii (Av) 细胞中表达并纯化了FeP和MoFeP，在特定的反应条件下，于启动酶促反应的短时间内完成样品制备，最终成功捕捉到了处于催化转化状态的复合物。冷冻样品中约35% 为MoFeP-FeP复合物，其中包括两种处于催化转化状态下不同构象的复合物，分别记作t/oComplex-1和t/oComplex-2，整体分辨率达2.3 Å (图2)。此外，研究者还解析了静息状态MoFeP (rsMoFeP) 1.8 Å的结构。
过去的晶体学研究提示FeP-MoFeP复合物中二者比例为2:1，但本文最初得到的两种复合物均为1:1，提示可能存在复合物的解体。在加入BeFx抑制ATP水解后，虽然样品中仍有大量1:1的复合物，但也出现了不少2:1的复合物。
在t/oComplex-1中，FeP的两个γ亚基都被ATP占据，并能清楚地观察到gamma-磷酸基团以及相应的Mg2+离子；但在t/oComplex-2中，γ1亚基含有ATP但磷酸基团的密度很弱，γ2亚基中为ADP，且没有磷酸基团的密度，提示ATP的水解是非对称性的。两个ATP分子的水解可能顺序发生，而t/oComplex-1和t/oComplex-2或许分别代表ATP水解的早期阶段和中期阶段。
早期的晶体结构提示FeP于MoFeP核苷酸依赖的相互作用存在三种对接模式，分别记作DG1、DG2和DG3。无核苷酸结合的条件下，主要以DG1存在；DG2为复合物的活化形式，ATP水解与电子传递偶联，FeP位于MoFeP α和β亚基之间的表面上；DG3为ATP水解为ADP后，FeP主要与α亚基结合。t/oComplex-1和t/oComplex-2之间的主要差异在于FeP部分 (图3)，主要表现为DG2的结合方式，在该状态下，FeP与MoFeP之间的接触非常广泛, [4Fe:4S]到P-cluster之间的距离很短，可能更利于电子传递的发生 (图4，左)。
在MoFeP部分，t/oComplex-1和t/oComplex-2的P-cluster处于完全还原的全铁模式 (PN)，二者的骨架以及rsMoFeP的骨架之间均无明显差异。但是在两种复合物中，无FeP结合的α2β2 (图4，右，distal部分)相比有FeP结合的α1β1(图4，右，proximal部分) 有一些特征上的改变，具体表现为：
1. α2β2的FeMoco附近有一些保守的氨基酸残基处于静息态构象，如α2Trp253、α2His274、α2Phe300、α2His451；
2. α2His442以及α2β2 MoFeco高柠檬酸盐 （homocitrate）配体附近的密度相比起α1β1一侧要差，这一现象在t/oComplex-2中比t/oComplex-1更明显，提示α2His442与高柠檬酸盐在催化转化的过程中的动态性 (图5)；
3. α2β2的部分结构域相比于其他部分存在较大的位置变动，在t/oComplex-2中尤为明显 (图5)。
不过，目前结果仍不能说明FeP与MoFeP之间的对接是如何引起α2β2亚基的构象变化以及在MoFeP循环中固氮酶究竟处于哪一种状态，深入理解固氮酶的工作机制仍有待未来进一步研究。
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https://www.science.org/doi/10.1126/science.abq7641
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