疫霉属(Phytophthora)的卵菌可造成多种植物病害，比如致病疫霉(P. infestans)、辣椒疫霉(P. capsici)、寄生疫霉(P. parasitica)、棕榈疫霉(P. palmivora)，大豆疫霉 (P. sojae)可分别造成马铃薯晚疫病、烟草黑胫病， 可可黑荚病，大豆疫病等等。马铃薯晚疫病曾经引发爱尔兰大饥荒，造成上百万人死亡。野生马铃薯和其他一些野生的茄科物种中含有大量的致病疫霉抗病基因。二倍体光果龙葵(Solanum americanum) 是野生的茄科物种，被认为是龙葵(Solanum nigrum)的祖先，它们都被认为具有晚疫病的非寄主抗性(non-host resistance)，因此光果龙葵是克隆致病疫霉抗病基因的理想材料。目前，除了马铃薯晚疫病和大豆疫霉的一些抗性基因已被克隆，很少有其他疫霉抗性基因的报道。Jonathan Jones团队在2015 首次从光果龙葵中克隆出晚疫病抗性基因Rpi-amr3 (Witek et al., 2016)，2021年又报导了另一个抗性基因Rpi-amr1及其对应的致病疫霉效应子AVRamr1 (Lin et al., 2020)。然而Rpi-amr3对应的无毒基因还未被发现。
2022年7月31日，英国TSL研究所(The Sainsbury Laboratory) Jonathan Jones课题组在Molecular Plant 在线发表了题为 A potato late blight resistance gene protects against multiple Phytophthora species by recognizing a broadly conserved RXLR-WY effector 的研究论文。
本研究首先进行了田间试验，测试Rpi-amr3在马铃薯栽培种中的田间抗性。在连续两年的田间试验中，作为对照的马铃薯在发病后一个月内就几乎被晚疫病全部摧毁，而转入Rpi-amr3的马铃薯表现良好。作者收获了2017年田间实验结束后的马铃薯，发现无论数量还是重量，转入Rpi-amr3的马铃薯都远超过对照组（注：在不染病的情况，转入Rpi-amr3的马铃薯和对照组的产量无统计上的显著差异）。田间试验证明了在马铃薯的生产中，Rpi-amr3能有效的对抗晚疫病，减少农药的使用以及产量的损失。作者进一步在实验室条件下，通过离体叶片接种的方式测试Rpi-amr3是否具有广谱抗性。结果表明转入Rpi-amr3的马铃薯和本氏烟草，均可以对所有测试的致病疫霉小种产生抗性，这个结果表明Rpi-amr3很可能识别一个在致病疫霉里非常保守的效应子。
接下来，为了找到Rpi-amr3对应的无毒基因，作者利用本氏烟草瞬时表达系统，筛选了超过300个RXLR类效应子，发现只有当共表达PITG_21190和Rpi-amr3时，能在烟草中引起特异性的细胞坏死(HR)。这个结果表明，PITG_21190就是Rpi-amr3对应的无毒基因, 即AVRamr3。接下来作者进一步证明了AVRamr3在所有致病疫霉的小种中序列高度保守，同时通过RT-PCR证明了Avramr3在致病疫霉侵染植物的过程中表达。
为了研究Rpi-amr3是否需要helper NLR发挥功能，作者利用烟草nrc2/3/4敲除的突变体进行互补实验，发现Rpi-amr3需要NRC2, NRC3或者NRC4才能行使其功能。在nrc2/3/4烟草突变体中共表达Rpi-amr3+AVRamr3不会引起HR，所以这个系统可以被用来研究Rpi-amr3和AVRamr3的互作。作者利用这个体系，通过 Co-IP和Split-luciferase等试验证明了Rpi-amr3和AVRamr3在植物体内互作。
作者在NCBI中对AVRamr3进行Blast时发现，其他疫霉中也有AVRamr3的同源蛋白，这和以往的认知不太相同，因为一般认为RXLR类效应子的进化速度非常快，具有物种特异性，在不同的疫霉物种中很少有保守的效应子。于是作者搜索了多个公开的卵菌基因组数据，发掘到多个AVRamr3的同源蛋白，比如P. parasitica, P. pluvialis, P. cactorum, P. ramorum, P. megakarya, P. lateralis, P. palmivora, P. litchi, P. sojae, P. cinnamon, P. capsici和 Hyaloperonospora arabidopsidis (Hpa) 基因组。为了研究这些不同疫霉物种中的AVRamr3是否都能被Rpi-amr3识别，作者合成了12个不同疫霉中Avramr3同源基因，并通过烟草瞬时表达系统测试它们是否能被Rpi-amr3识别，结果表明，除了P. capsici， P. ramorum和Hpa中的AVRamr3同源蛋白, 其他所有AVRamr3同源蛋白和Rpi-amr3共表达都能触发HR。有意思的是，从序列的角度来看，AVRamr3的相似度并不高，但通过AlphaFold的预测，我们发现这些AVRamr3同源蛋白的结构非常相似。再次，利用nrc2/3/4敲除的烟草，我们用Co-IP和Split-luciferase等实验证明了Rpi-amr3和多个AVRamr3同源蛋白都在植物体内互作。
之前提到过，目前除了致病疫霉和大豆疫霉，还没有克隆到任何其他疫霉的抗性基因，所以很自然的，作者想研究Rpi-amr3对于不同物种中AVRamr3的识别，是否能产生抗性？为了回答这个问题，作者构建了稳定转入Rpi-amr3的本氏烟草，并利用这个系统建立了P. parasitica和P. palmivora根部侵染的实验体系。P. parasitica和P. palmivora 均能侵染多种不同家族的植物，其中在生产上比较严重的是P. parasitica造成的烟草黑胫病和P. palmivora造成的可可黑荚病。在这个实验中，我们发现Rpi-amr3在烟草中确实可以抗P. parasitica和P. palmivora的一些小种。这使得Rpi-amr3成为了第一个报道的P. parasitica和P. palmivora的抗病基因。不过，我们同时也发现P. parasitica和P. palmivora的某些小种能克服Rpi-amr3的抗性，接下来需要进一步研究这些小种克服抗性的毒性机理。
最后，为了探索Rpi-amr3在光果龙葵和龙葵中的分布，作者利用AVRamr3作为探针，通过瞬时表达的方法观察哪些材料能够识别AVRamr3。结果表明Rpi-amr3在光果龙葵和龙葵普遍存在，为了进一步验证这个结果，作者克隆了几个Rpi-amr3在光果龙葵和龙葵 (Rpi-nig3)中的同源基因，发现它们均能识别AVRamr3。结合之前Rpi-amr1/Rpi-nig1的发现(Witek et al., 2021), 这证明Rpi-amr1/Rpi-nig1和Rpi-amr3/Rpi-nig3均对光果龙葵/龙葵对晚疫病的非寄主抗性有贡献。
做了进一步研究Rpi-amr3激活的机理，Jonathan Jones团队的Hee-Kyung Ahn博士和本文的作者林啸博士合作，在最近发布的一篇预印本文章中报导了Rpi-amr3激活的机理。该研究发现和已经报导的ZAR1抗病小体不同的是，Rpi-amr3在识别AVRamr3后，并不会自己形成抗病小体，而是激活helper NLR NRC2形成抗病小体(Ahn et al., 2022)，在这篇报导中，作者还发现其他疫霉中能被识别的AVRamr3同源蛋白在被Rpi-amr3识别后同样能激活NRC2形成抗病小体，而不能被识别的AVRamr3同源蛋白则不能激活NRC2抗病小体。结合本文的发现，这些结果非常有启发，为Rpi-amr3在不同植物中的应用打下了理论基础，因为NRC基因并不是在所有植物中都存在，如果想要在缺少NRC的作物中利用Rpi-amr3基因产生对不同疫霉的抗性，可能需要将Rpi-amr3和NRC基因一起转入才能产生抗性。
综上，本研究在大田和实验室条件下评估了Rpi-amr3在栽培马铃薯中的抗性。克隆到了Rpi-amr3识别的效应子AVRamr3, 并发现AVRamr3不仅在致病疫霉中保守，还在其它疫霉物种中广泛存在同源蛋白。接着，本研究发现从光果龙葵中克隆到的晚疫病抗性基因Rpi-amr3不仅可以用于马铃薯晚疫病的防治，还可以应用到不同的作物中，对抗多种不同的疫霉病害。本研究为植物抗病基因的发掘和应用提供了新的思路，并首次报导了寄生疫霉及棕榈疫霉的抗性基因。
英国TSL研究所(The Sainsbury Laboratory)的博士后林啸为本论文第一作者， Jonathan D. G. Jones教授为通讯作者。本研究由英国生物技术与生物科学研究委员会（BBSRC）和Gatsby 基金会资助。
转自：植物科学SCI
如有侵权，请联系本站删除！
