Nature Com｜法国学者揭示4-磷酸磷脂酰肌醇控制拟南芥自噬体的形成

2022年7月28日，法国波尔多大学膜生物发生实验室Amélie Bernard科研团队在国际著名期刊Nature Communications发表题为“Phosphatidylinositol-4-phosphate controls autophagosome formation in Arabidopsis thaliana”的研究论文。本研究使用药理学和遗传学方法揭示了脂质磷脂酰肌醇-4-磷酸（PIP4）在拟南芥自噬中的重要性。

https://doi.org/10.1038/s41467-022-32109-2

自噬是一种高度进化保守的过程，对于植物适应环境胁迫至关重要。自噬是细胞内的一种降解机制，自噬的核心是形成专门的囊泡，即自噬体（autophagosome ，AP）。自噬体可以靶向将特定的物质，例如蛋白质、蛋白质聚集体、细胞器、入侵病原体等运送到裂解液泡中。然而自噬体是如何在植物细胞中形成的，仍然知之甚少。

为了确定哪些脂质会影响植物的自噬过程，研究者首先进行了脂质抑制剂筛选。在自噬过程中，ATG8被募集到吞噬细胞的膜上，研究者使用GFP-ATG8测定法，检测脂质抑制剂在营养缺乏条件下对自噬活性的影响。实验显示，使用磷脂酰肌醇-4-激酶（PI4K）抑制剂PAO处理幼苗后，游离GFP积累大幅减少，表明细胞中自噬活性受阻（图1a-d）。接下来，研究者使用PI4P的荧光探针mCitrine-PHOSBP检测了PAO处理条件下荧光的变化。显示，PAO的处理能使PI4P在细胞膜上的定位扩散至细胞溶胶中，表明PAO抑制了PI4P的表达。雷帕霉素靶点(TOR)在细胞自噬中发挥重要作用。使用TOR抑制剂AZD和PAO同时处理时，GFP-ATG8向游离GFP的降解以剂量依赖性方式停滞（图1e，f)，表明表明TOR诱导的自噬激活需要PI4K活性。

为了从基因水平上探究POA及PI4P对自噬的影响，研究者使用反向遗传学比较了PIKα1和PI4Kβ在自噬活性中的相对贡献。使用RNA干扰及筛选T-DNA突变体获得了amiRNA:PI4Kα1和pi4kβ1 pi4kβ2植株。在缺乏氮和碳(-NC)的MS板中诱导自噬，显示大多数amiRNA:PI4Kα1幼苗表现衰老表型，同时死亡率远低于野生型。表明PI4Kα1 参与了自噬。接下来，研究者比较突变体中自噬衔接蛋白NBR1的降解速率。营养饥饿诱导自噬时，在amiRNA:PI4Kα1突变体中，发生了蛋白质过度积累（图 2b，c，右图），表明在PI4Kα1抑制后，NBR1的降解发生改变。

那么PI4P在自噬中发挥作用的具体步骤是什么？使用共聚焦显微镜观察发现，使用PAO处理时，检测到的GFP-ATG8非常少，而GFP-ATG8主要存在于胞质溶胶中，这表明AP的形成被阻止。以上结果说明PI4P对于AP形成至关重要。形成AP的先决条件是将中心蛋白ATG8募集到吞噬细胞膜上，这需要ATG8与脂质PE共价结合。在免疫印迹实验中，PAO处理后膜中ATG8-PE带的水平显著降低（图3），表明在没有PI4K的情况下，ATG8的脂化受到了抑制。同样，在amiRNA:PI4Kα1植株中，ATG8-PE的结合和降解都受到阻碍，再次验证了PI4P在自噬途径中发挥作用。通过对更早期自噬结构相关基因的分析，显示PIP4并未阻止自噬早期组分膜的结合，这表明PI4K通过控制吞噬细胞的正确组装和伸长发挥作用。

PI4P是植物细胞质膜（PM）上的一种主要阴离子磷脂。那么PI4P是否存在于自噬膜上？研究者使用了一组PI4P特异性探针进行分析。在营养缺乏条件下处理2/5小时，只能观察到很少的PI4P信号与ATG8标记结构的共定位情况。在自噬诱导5小时后，10%的 PI4P点状结构显示出ATG8f-mCherry共定位信号。使用液泡水解酶抑制剂刀豆素A（可导致自噬体在液泡中的积累）进行处理，PI4P信号以点的形式积累，这些点与ATG8共定位重合率高达80%，表明PI4P标记自噬体（图4）。

进一步使用光电联动显微镜进行观察，显示ATG8和ATG5的荧光标记出现的位置接近于PM或PI4P。此外，在PM 或高尔基体（<300 nm）附近也发现了大量的ATG8 结构。以上结果暗示着PM为AP形成提供了一个关键平台，通过提供AP形成所需的PI4P，促进自噬过程。

综上所述，本研究通过脂质抑制剂筛选，功能表征了在拟南芥中参与自噬的关键脂质。本实验通过药理学分析及基因抑制PI4P合成，均证实了PI4P的缺失可阻断植物细胞中的自噬过程。通过结合生化和活体显微镜分析，发现PI4K活性是AP形成所必需的。总之，本研究证实了脂质在自噬过程中的关键作用。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41467-022-32109-2

转自：植物科学SCI

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