Prime editing (先导编辑，PE) 是一种精准的基因编辑技术，可以在细胞和动物中以可编程方式安装替换、插入和缺失，而无需双链 DNA 断裂 (double-strand DNA breaks, DSBs)。与其他人体细胞的编辑程序相比，PE 具有更高的精度和多功能性，可在2-4周内完成。与基于同源定向修复的方法相比，PE的机制使其对细胞复制和内源性DNA修复的依赖性更低，并且它能够在不产生DSB的情况下精确安装编辑，从而最大限度地减少插入缺失和其他不良结果。
自最初发布以来，PE的功能也得到了扩展。增强型PE系统PE4和PE5通过控制DNA修复途径以提高PE效率并减少插入缺失；工程化pegRNA (engineered pegRNAs, epegRNAs) 利用稳定和保护pegRNA 3' 末端的结构化 RNA 基序，以及改善编辑器表达和核定位的PEmax架构来提高PE效率；新应用如Twin PE可以精确插入或删除数百个DNA碱基对，并且可以与重组酶一起使用以实现基因大小 (>5 kb) 的插入和倒位。然而，实现最佳PE需要细致的实验设计，并且影响PE结果的大量参数可能令人生畏。
2022年8月8日，博德研究所刘如谦（David R.Liu）团队在Nature Protocols（IF=17）杂志在线发表题为“Designing and executing prime editing experiments in mammalian cells”的研究论文。该论文描述了当前进行PE和twinPE实验的最佳实践，并设计和优化了pegRNA，并且提供了如何选择合适的PE系统（PE1到PE5和 twinPE）的指南。最后，该研究还提供了有关如何在哺乳动物细胞中进行PE的详细说明。
另外，2022年7月28日，博德研究所刘如谦（David R. Liu）团队在Nature Biomedical Engineering（IF=29）在线发表题为“Efficient in vivo base editing via single adeno-associated viruses with size-optimized genomes encoding compact adenine base editors”的研究论文，该研究在单个 AAV 中编码的 ABE 将通过简化 AAV 的产生和表征以及减少所需编辑水平所需的剂量来促进碱基编辑的研究和治疗应用（点击阅读）。
2022年7月6日，博德研究所刘如谦（David R. Liu）团队在Cell 在线发表题为“Therapeutic in vivo delivery of gene editing agents”的综述文章，该综述回顾了当前用于实现治疗性体内基因编辑的递送技术，包括病毒载体、脂质纳米颗粒和病毒样颗粒。由于没有一种交付方式可能适用于所有可能的应用，因此该综述比较了每种方法的优缺点，并强调了未来改进的机会。
成簇的规则间隔短回文重复 (CRISPR)-Cas系统能够以前所未有的速度以及便利性和可编程性来操纵生命系统中的基因。用于基础研究的CRISPR衍生编辑剂彻底改变了我们对生物系统的理解，并且还被用于离体和体内治疗镰状细胞病、β-地中海贫血和转甲状腺素蛋白淀粉样变性患者。
然而，早期基因编辑技术对双链DNA断裂 (DSB) 的依赖限制了编辑的类型，可以使用的可编程核酸酶（例如CRISPR-Cas9）主要针对那些破坏或删除基因的编辑，DSB还可能导致各种不良结果，例如靶位点的插入和缺失 (indel) 、易位、大片段缺失、非整倍体、染色体碎裂和p53激活，这些后果都能丰富致癌细胞。虽然使用DSB和供体DNA模板的同源定向修复 (homologydirected repair, HDR) 已成功用于纠正而不是破坏包括干细胞和T细胞在内的细胞类型的突变，但因为HDR所需的细胞机制依赖于细胞周期，因此已被证明在大多数治疗相关的细胞类型中，HDR介导的校正效率低下。
使用核酸酶校正基因所固有的困难限制了研究和治疗遗传疾病的潜在能力，其中大多数治疗需要靶向基因校正，而不是基因破坏。这些因素刺激了不需要切割DNA双螺旋的精密可编程基因校正技术的发展。除了基因破坏之外，碱基编辑是无DSB介导基因校正的编辑方法，胞嘧啶碱基编辑器 (Cytosine base editors, CBEs) 和腺嘌呤碱基编辑器 (adenine base editors, ABEs) 可以分别精确安装C•G-to-T•A突变和A•T-to-G•C突变，而无需DSB。
为了在不需要DSB的情况下进一步扩大基因精确校正的范围，研究者们最近开发了PE。Prime 编辑器 (PE) 无需DSB即可实现精确、高度通用的替换、插入、删除或组合编辑。
最初的主编辑器PE1由与莫洛尼鼠白血病病毒 (Moloney murine leukemia virus, M-MLV) 逆转录酶 (RT) 融合的Cas9 (H840A) 切口酶组成（图 1），并使用一种称为PE引导RNA (PE guide RNA, pegRNA)（图 2），pegRNA拥有一个额外的3'延伸，其中包含一个编码所需的逆转录模板 (RTT)，以及一个与基因组靶点互补的引物结合位点 (primer-binding site, PBS)。
一旦被递送到细胞中，pegRNA 的间隔子将主要编辑蛋白靶向特定的目标基因座。然后Cas9结构域结合并切割目标DNA，露出3'末端。pegRNA的PBS然后退火到这个3'端，主要编辑器的RT域使用生成的DNA/RNA双链体作为底物。目标DNA 3' 端作为引物，RT延伸瓣，合成pegRNA的RTT编码的序列。得到的新合成的DNA 3' 瓣包含所需的编辑（替换、插入、删除或其组合），然后是下游同源性。这种下游同源性导致瓣平衡和编辑的3' 瓣与未编辑的互补目标链杂交。随后的DNA修复，包括细胞先天切割5' DNA 瓣的倾向，将编辑合并到两条目标 DNA 链中（图 1）。
与DSB介导的基因组编辑技术相比，PE提供了更高的编辑与缺失比率，并且对细胞修复途径的依赖性更低。高效PE已在许多细胞类型中得到证实，包括原代皮层神经元、T 细胞、诱导多能干细胞 (iPSC) 和患者来源的成纤维细胞。此外，由于所需的编辑编码在pegRNA中，不需要外源DNA模板的传递，这简化了基础研究实验并极大地促进了体内传递。最后，脱靶编辑在PE中被最小化。此外，最近的三项研究没有从PE中检测到任何不依赖Cas9的脱靶，这是通过对编辑过的人类干细胞衍生的肠道和肝脏类器官、胚胎干细胞和水稻植物进行克隆全基因组测序来测量的。
为了优化新位点的 PE，首先设计并克隆一组初始 epegRNA。然后通过转染主力细胞系（如HEK293T细胞或N2A细胞）筛选这些epegRNA。PE2或PE4 应用于此初始筛选，以避免串联筛选切口 sgRNA。根据这个初始筛选的测序结果，可以进行额外的优化。如果观察到低编辑效率，建议筛选额外的PBS和RTT长度。一旦找到最佳的PBS和RTT长度，就可以使用优化的epegRNA 测试额外的改进，例如切口sgRNA和MMR规避突变。
总体而言，PE提供了跨多种细胞类型的通用、高效和精确的基因组编辑，且脱靶编辑最少。该研究详细说明了如何在哺乳动物细胞中使用PE，以及如何选择与给定应用程序匹配的PE系统，并优化了PE系统，为PE系统的广泛应用提供详细指导。
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41596-022-00724-4
转自： iNature
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