Science Advances | 一种实时监测植物活细胞内葡萄糖浓度方法

DNA适配体（aptamer）是一种短的、单链DNA分子，它能选择性地结合到特定靶标分子上，比如蛋白、糖类、生物小分子甚至活细胞。由于DNA适配体合成简单化学特性稳定，它已经作为生物传感器广泛地被用于检测各种生物分子。然而迄今为止，DNA适配体还未被用于监测植物体内的任何靶标分子。造成这一情况的主要障碍是还没有一个有效的递送DNA分子进入植物细胞的方法。2022年6月29日，Science Advances发表了伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校CABBI中心的Lu Yi团队的题为“efficient delivery of a DNA aptamer-based biosensor into plant cells for glucose sensing through thiol-mediated uptake”的研究论文，报道了通过一种巯基介导的高效率DNA摄取法递送DNA分子进入植物活细胞内，并且成功地通过此法高效递送葡萄糖DNA适配体生物传感器到拟南芥体内监测葡萄糖。该研究为开发利用DNA适配体感受器监测植物体内各种生物分子打开一扇门。

目前递送DNA分子进入植物细胞的方法包括农杆菌介导法、基因枪轰击法、纳米材料法等等，这些方法比较低效有些会损坏植物细胞，严重限制了在植物里的应用。递送DNA进入植物细胞主要有两层障碍：细胞壁和细胞膜。植物细胞壁是由相互交织的多糖形成的网状结构，孔径大概在5-20纳米。克服这层障碍就要求递送的分子要小于20纳米。克服细胞膜的障碍可以从哺乳动物递送系统获得启发。哺乳动物只有细胞膜，巯基介导的摄取被成功地应用到DNA递送到细胞内部。受此启发，作者首先合成了一条双硫化修饰的协助链5’-ACACGGTCGTT/iSp18//SS/15-3’(称作SS-HS)。该链含有一个18原子的六-乙二醇间隔子（iSp）和15次重复的双硫单元（SS）。这样的寡核苷酸尺寸小于20纳米。然后合成了含有SS-HS的互补链和3’-FAM的一条链（DNA-FAM）与SS-HS互补来监测SS-HS的递送过程。转染海拉细胞(HeLa)显示，杂合链SS-HS/DNA-FAM荧光强度比没有双硫单元的DNA-FAM荧光强度高21倍，说明重复的双硫单元对递送DNA进入海拉细胞非常有效。由此，作者测试该体系在植物中的效果（图1A）。在注射植物叶子24小时后，用荧光共聚焦显微镜观察发现植物叶子中SS-HS/DNA-FAM的荧光强度比DNA-FAM的高14倍（拟南芥）和17倍（烟草）（图1B），说明该系统在植物中也是高效的。

最近报导的一种三维DNA四面体方法能有效递送生物分子进入植物细胞。为了评估巯基-介导的方法，作者比较了这两种方法的递送效率（图2A）。首先，作者合成了DNA四面体TET-FAM（图2B）。比较结果显示叶子中SS-HS/DNA-FAM的荧光笔TET-FAM的荧光强度高2倍（图2C-D），说明巯基-介导的方法比DNA四面体方法递送DNA进入植物细胞更有效。

为了评估双硫单元-协助的递送体系的动态，接下来作者测试了双硫递送体系在植物细胞里的时序性动态变化（图3A）。注射10分钟后，双硫递送体系在植物里产生强烈的荧光信号。60分钟后，没有双硫的DNA-FAM荧光信号消失但SS-HS/DNA-FAM荧光信号仍然很强（图3A）。为了确认该体系的递送是通过巯基介导的，作者接着使用了两种巯基摄取抑制剂：一种强抑制剂sodium iodoacetate和一种弱抑制剂DTNB。注射烟草实验结果表明，加了两种抑制剂后荧光强度比没加的要低（图3B）。而进一步荧光定量表明，加弱抑制剂和强抑制剂的荧光强度分别是未加的44.3%和18.2%，表明该递送是通过巯基介导的。

为了提供一个该方法递送的实例，作者接着调查该方法递送DNA适配体葡萄糖传感器到植物细胞中的情况。已报道，野生型拟南芥细胞里的葡萄糖是突变体atsweet11:12中的2倍。作者用SS-HS杂交葡萄糖FRET传感器形成SS-HS/GluS(图4A)。同时用SS-HS/SCR作为对照。体外实验表明，GluS的FRET荧光对葡萄糖有反应而SCR没有变化（图4B）。然后，作者注射SS-HS/GluS和SS-HS/SCR到野生型和突变体拟南芥中，结果发现野生型里的SS-HS/GluS的FRET荧光比突变体里的要低，表明野生型葡萄糖的浓度高（图4C-D）。而对照SS-HS/SCR没有变化。该结果验证了SS-HS递送体系的有效性。

总之，作者开发了一种应用于植物细胞的高效的巯基介导的DNA递送体系，并应用该体系成功递送DNA适配体葡萄糖传感器到拟南芥叶子里监测到葡萄糖浓度。该方法扫除了应用DNA分子探针实时探测植物生物分子的研究的一个障碍，为研究者提供了一个好的技术基础。

转自：植物科学最前沿

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