Protein ＆ Cell ：上科大马涵慧团队开发新型先导编辑器，具有更高基因编辑效率和灵活性

绝大多数遗传性疾病都是由于基因上的位点突变、插入或缺失导致的。2019年，碱基编辑技术开创者 David Liu 团队开发出了一款基于 CRISPR 的新型基因编辑技术——先导编辑（Prime editor，PE），这款新型编辑器能够在不引入双链 DNA 断裂的情况下，无需额外添加供体模板，便可实现点突变、DNA 片段插入或筛除。但是先导编辑在很多基因位点的编辑效率非常低，因此，提高其编辑效率仍是一个亟需解决的问题。

近日，上海科技大学生命学院马涵慧课题组在 Protein ＆ Cell 期刊发表了题为：Enhancing Prime Editing Efficiency and Flexibility with Tethered and Split pegRNAs 研究论文，开发了三种高效灵活的先导基因编辑工具：3'-Stem loop PEs（sPEs）、Tethered PEs（tPEs）和Split pegRNA PEs（SnPEs）。

PE编辑器发挥作用需要经过以下五个步骤：组装、搜索、靶向、定位、编辑。在这个过程中，pegRNA被降解或者自身环化以及pegRNA的3'端在复合物形成后进入Cas9与5'端的spacer结合都会影响对目标位点的靶向，最终影响编辑效率。研究团队从先导编辑器靶向目标 DNA 效率入手研究，利用团队此前开发的 CRISPRainbow 成像技术，发现先导编辑器的 DNA 靶向效率非常低，这有可能由于 pegRNA 自身的稳定性或非正常的折叠，也可能是由于组装的 Cas9/pegRNA 的 DNA 靶向能力下降。而其目标 DNA 靶向能力可以通过在 pegRNA 的3'-末端加 RNA 适配体（比如pegRNA-MS2）得到恢复 。

使用CRISPR成像系统的三种系统的示意图。在使用GE和PE-MS2系统的细胞中可以观察到有亮点出现，说明这两种系统可以很好地靶向目标位点；在使用PE系统的细胞中几乎无法观察到有亮点出现，说明PE系统不能很好地靶向目标位点。基于这一发现，团队开发了一系列优化的先导编辑基因编辑系统，包括3'-Stem loop PEs（sPEs）、Tethered PEs（tPEs）和Split pegRNA PEs（SnPEs）。
通过在 pegRNA 的3'端添加 RNA 适配体（sPE）以及在 Cas9 上连接 RNA 适配体的结合蛋白（tPE），发现 sPE 和 tPE 系统在不同细胞中的编辑效率相比于先导编辑均有所提高，尤其是在片段插入与筛除的应用中编辑效率远高于先导编辑系统。同时为了增加更多改造的灵活性，研究团队将 pegRNA 拆分为 sgRNA 和 pRNA （prime RNA）。 SnPE 不仅解决了在插入与缺失大片段时 pegRNA 难以稳定存在的问题，还为诱导型先导编辑系统（iPEs）提供了良好的基础。

PE、sPE、tPE、SnPE系统的示意图。PE、sPE和tPE在HeLa细胞中10个不同位点的基因编辑效率。使用不同RNA适配体的SnPE系统在293FT细胞中RUNX1位点诱导三碱基插入和删除的编辑效率。上科大生命学院访问生、华东理工大学博士研究生冯颖，上海科技大学生命学院2020级研究生刘思远为共同第一作者，上海科技大学生命学院助理教授马涵慧为通讯作者。

论文链接：https: //doi.org/10.1093/procel/pwac014

转自：硕博一线

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