【单细胞农学专题】单细胞转录组在病害防治研究中的应用（下）

上期我们为大家介绍了单细胞转录组在病害防治研究中的应用，主要从两个方面入手，其一是病原物种带poly A，其RNA序列可以被捕获，故可从病原物种RNA分布差异入手，分析其入侵偏好；其二是宿主免疫研究，即从感染前后，宿主免疫细胞图谱入手，分析宿主对病原物种的免疫响应机制。
上期借助家蚕抗病毒案例，为大家详细展示了从病原物种角度出发，探究病毒入侵偏好的完整分析思路。这周将继续为大家分享第二种，从宿主角度出发，探究宿主免疫响应机制、间接分析病原物种入侵偏好的分析思路。这一类分析思路主要从细胞图谱入手，以细胞亚群在病原物种感染前后的频率变化为切入点，筛选显著差异细胞亚群，分析细胞亚群基因表达特征及分化命运关系，从特征基因中挖掘入侵偏好，从分化命运关系中获取宿主免疫响应机制。
同样还是以一篇文献案例带大家直观认知第二种，从宿主角度出发的分析思路。以下这篇文章同样是基迪奥合作客户在2021年7月发表在plos pathogens期刊，有关石斑鱼抗病毒机制的研究。基迪奥为客户提供了完整的单细胞转录组测序及数据分析服务。下面我们来看一下文章具体的研究思路。

合作单位：华南农业大学

发表期刊：plos pathogens

影响因子：7.46

发表时间：2021年7月

#研究背景#

病毒性神经坏死(VNN)是由神经坏死病毒(NNV)引起的一种急性、严重的鱼类疾病。NNV是海洋鱼类中最具传染性和经济破坏性的病毒之一，可导致严重的中枢神经系统细胞坏死和空泡性损害。由于中枢神经系统的功能多样性以及高度复杂的解剖结构和细胞组成，很难破译宿主的易感细胞和免疫反应机制。因此，作者使用单细胞转录组技术绘制了石斑鱼中脑的细胞图谱；确定免疫细胞的转录谱，识别感染病毒组织中富集的免疫细胞及其潜在功能。

#实验设计#

NNV和PBS分别注射两组石斑鱼中脑，获得处理组和对照组，取中脑组织的细胞核进行单细胞转录组测序及数据分析。

#研究思路#

#结果解读#

1. 石斑鱼中脑组织的细胞图谱

由于中枢神经系统（CNS）的功能多样性和高度复杂的细胞类型组成，作者使用scRNA-seq技术得到高分辨率的石斑鱼中脑组织细胞图谱。文章分别收集到对照组和RGNNV感染组的13533个和12464个石斑鱼的中脑细胞。细胞聚类分群得到了35个亚群（图1A），并使用marker基因对亚群进行细胞注释，例如，Syt1和Snap25基因鉴定神经元细胞，Sox10和Disc1基因鉴定少突胶质细胞。最后得到5个细胞类型——为神经细胞、少突胶质细胞、星形胶质细胞、免疫细胞、内皮细胞（图1B）。

2. 巨噬细胞对病毒感染的响应机制

为了研究宿主的免疫反应机制，作者进一步将免疫细胞细分为巨噬细胞、小胶质细胞、T细胞和未定义细胞四个细胞亚型，并发现在病毒感染组中巨噬细胞数量明显增加（图3A）。为了进一步研究RGNNV感染后巨噬细胞基因转录水平的变化，本文比较了对照和 RGNNV 感染细胞之间基因的表达模式，病毒感染组显著上调的基因主要与免疫相关，基因表达水平分析表明，大多数促炎因子基因在感染鱼中的表达较高，例如肿瘤坏死因子 α (TNFα)、白细胞介素 1 (IL1)和 NFκB（图3B）。进一步对免疫细胞进行拟时分析，可见小胶质细胞向巨噬细胞的分化，而巨噬细胞也明显分化为M1和M2两种子亚型，病毒免疫相关的促炎因子又主要在M1中表达(图3C)。这揭示了在病毒感染过程中，巨噬细胞的分化来源以及M1巨噬细胞对病毒感染的相应作用。

3. GLU1和GLU3是RGNNV的易感细胞

为了确定病毒易感细胞，作者对神经细胞不同细胞亚群的细胞数量进行分析，发现RGNNV感染后，GLU1和GLU3细胞数量减少最多（图4A）。为了证实RGNNV对GLU1和GLU3亚群细胞的攻击，以在GLU1和GLU3亚群细胞中均高表达的Slc17a7作为标记基因（图4B），在FISH实验中可见RGNNV与GLU1和GLU3神经细胞共定位。这从组学和分子生物学两个方面印证了GLU1和GLU3是RGNNV的易感基因。

4. 神经细胞受病毒攻击后凋亡

为了进一步研究RGNNV感染后GLU1和GLU3的转录组变化，作者比较了对照和RGNNV感染的表达模式，研究发现膜形成、转移和自噬相关通路的 DEGs 在 RGNNV 感染组中显着富集，以及高表达的F型蛋白酪氨酸磷酸酶受体(ptprf)、血管活性肠肽受体2 (vipr2)、热休克蛋白90 (hsp90)、赖氨酸(K)特异性脱甲基酶6B(kdm6b)、rho-GTPase激活蛋白6 (arhgap6)和溶质载体家族6成员6 (slc6a6)。

小结

这篇文章有两条清晰的研究主线，一是围绕感染病毒组织中免疫细胞丰度及其潜在功能，探究宿主免疫响应机制；二是围绕病毒感染后神经细胞的丰度变化和功能差异，探究病毒入侵偏好。使用的都是基础的分析方法，包括细胞频率分析、组间差异分析、拟时分析等。最终揭示了，RGNNV病毒主要靶向 GLU1 和 GLU3 神经元细胞，并诱导神经元细胞凋亡；巨噬细胞在 RGNNV 感染组织中富集，具有明显的炎症反应，并且小胶质细胞通过转化为 M1 型活化的巨噬细胞，产生细胞因子以减少病毒对神经组织的损伤。
这篇文章是非常典型的从宿主角度出发，探究宿主免疫响应机制、间接分析病原物种入侵偏好的案例。这种研究思路相比于从病原物种出发，依赖ploy A尾结构的分析思路而言，具有更强的普适性，可以推广到所有农学物种的病害防治研究中~

转自：基迪奥生物

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