PNAS/Cell子刊 | 3篇！颜宁/潘孝敬解析电压门控钠通道蛋白的结构

电压门控钠 (Nav ) 通道 Nav1.7 已成为开发非成瘾性止痛药的靶标。Nav1.7 处于不同功能状态的结构将提供机制理解并帮助药物发现。2022年7月25日，原清华大学/普林斯顿大学颜宁及清华大学潘孝敬共同通讯在PNAS 在线发表题为“Unwinding and spiral sliding of S4 and domain rotation of VSD during the electromechanical coupling in Nav1.7”的研究论文，该研究报告了人类 Nav1.7 变体的冷冻电子显微镜分析，该变体具有 11 个合理引入的点突变，具有明显右移的激活电压曲线，V1/2 达到 69 mV。分辨率为 2.7 Å 的结构中的第一个重复 (VSDI) 中的电压感应域显示出完全向下（失活）的构象。与 WT Nav1.7 的结构相比，VSDI 中的三个门控电荷 (GC) 残基通过螺旋展开和 S4I 的螺旋滑动和~20° 结构域旋转的组合转移到胞质侧。S3I 细胞质末端的保守 WNФФD 基序稳定了 VSDI 的向下构象。一个 GC 残基主要通过螺旋滑动转移到 VSDII 中。伴随 VSDI 和 VSDII 中的 GC 转移，细胞内门的重排和收缩是通过相邻节段（包括 S4-5I、S4-5II、S5II 和所有 S6 节段）的协同运动来实现的。总之，该研究为单链电压门控离子通道的机电耦合机制提供了重要的见解，并为许多疼痛相关突变提供了分子解释，这些突变的致病机制无法从先前报道的 Nav 结构中揭示。另外，2022年7月19日，原清华大学/普林斯顿大学颜宁及清华大学潘孝敬共同通讯在PNAS在线发表题为“Structural basis for high-voltage activation and subtype-specific inhibition of human Nav1.8”的研究论文，该研究报告了全长人类 Nav1.8 的结构并与 A-803467 结合的结构。第一个电压感应域 (VSDI) 显示三种不同的构象。结构引导诱变确定了 VSDI 和孔域 (PD) 之间的细胞外界面是激活的高压依赖性的决定因素。 A-803467 在 PD 的中央腔内清晰地解决，握紧 S6IV。结构引导功能表征表明，两个非配体结合残基，S6I 上的 Thr397 和 S6III 上的 Gly1406，变构调节通道对 A-803467 的敏感性。人类Nav 通道可用结构的比较表明，细胞外环区域是开发亚型特异性孔阻塞生物制剂的潜在位点。总之，该研究的结构和功能分析为 Nav1.8 独特的生物物理特性的分子基础提供了重要的见解，并作为未来研究的框架。

2022年4月26日，普林斯顿大学颜宁及西湖大学申怀宗共同通讯在Cell Reports 在线发表题为”High-resolution structures of human Nav1.7 reveal gating modulation through α-π helical transition of S6IV“的研究论文，该研究报告了与 β1 和 β2 亚基复合的野生型 (WT) Nav1.7 的 2.2-Å 分辨率冷冻电镜结构，揭示了几个以前难以辨认的胞质片段。 重新处理报告的与各种毒素结合的 Nav1.7（E406K）结构的冷冻 EM 数据确定了 S6IV 的两种不同构象，一种仅由 α 螺旋转角组成，另一种在中间包含 π 螺旋转角。在 3.5-Å 分辨率下测定的无配体 Nav1.7(E406K) 的结构与 WT 通道相同，证实了 Huwentoxin IV 或 Protoxin II 与 VSDII 的结合变构诱导了 S6IV 的 α → π 转变。这种局部二级结构转变对孔域 (PD) 门控具有重大影响，并重塑了快速失活基序 Ile/Phe/Mel (IFM) 的适应位点。人类野生型Nav1.7 的高分辨率结构为有助于药物发现的进一步生物物理和计算分析提供了准确的模板。肽门控修饰毒素 (GMTs) 结合后的构象变化揭示了 GMT 对孔门控的变构调节的机制理解（点击阅读）。

由 SCN9A 编码的电压门控钠 (Nav) 通道 Nav1.7 在背根神经节的痛觉神经元中高度表达，并放大膜去极化以触发动作电位。 Nav1.7 功能的丧失可以消除痛觉，而其通道活动的增强与极度疼痛障碍有关。因此，Nav1.7 已成为开发下一代止痛药的靶标。以多种功能状态捕获 Nav1.7 的结构以促进药物发现至关重要。与同源四聚体 Kv 和细菌 Nav 通道不同，真核生物 Nav 通道以及 Cav 通道由一个包含四个同源跨膜重复序列的单多肽链组成。与所有其他电压门控离子通道类似，Nav 通道包含两个基本功能模块，中央离子传导孔域 (PD) 和四个侧翼电压感应域 (VSD)。每个VSD由四个跨膜片段（S1到S4）组成，其中S4负责检测膜电位。四到六个 Arg 或 Lys 残基，称为门控电荷 (GC)，在 S4 上以三个残基间隔出现。这些带正电荷的残基在静息膜电位下面向胞质侧，定义为“下降”或失活状态。在膜去极化后，GC 残基向细胞外侧移动以达到“向上”或激活状态。在 Nav通道激活期间，每个 VSD 中会传输两到三个 GC。 VSD 的构象变化以变构方式传递到 PD 以控制孔门控，这一过程称为机电耦合 (EMC)。Nav 通道的 EMC 循环中的主要步骤包括响应膜去极化（激活）从静息状态转变为激活状态，激活后以毫秒级关闭通道（快速失活），并返回静息状态超极化（失活）。

一个合理设计的 Nav1.7 变体，具有右移电压依赖性，用于激活和失活，显示出与 WT 通道的显着构象变化（图源自PNAS ）在结构阐明之前，几十年的电生理学、生物物理学和药理学表征已经预测了主要状态的以下构象特征：在静止状态下，VSD 处于“关闭”状态，PD 关闭。激活状态具有相反的构象，具有“向上”的 VSD 和导电的 PD。 Nav通道可以通过快速和慢速机制来停用。失活的通道是不导电的，并且由于去极化的膜电位，VSD 至少部分上升。尽管快速灭活是由位于重复 III 和 IV 之间的短接头（III-IV 接头）上的 Ile/Phe/Met (IFM) 基序执行的，但缓慢灭活的决定因素和机制仍然难以捉摸。Nav 结构库中的异常值是 NavPaS，这是第一个已解析的真核 Nav 通道结构。 NavPaS 的 VSD I、II 和 IV 中的 GC 残基比脊椎动物 Nav 结构中相应的低 1 到 1.5 个螺旋圈； PD紧密关闭，没有开窗； S4-5收缩环更收缩。最显著的特征出现在 III-IV 接头中，它与球状羧基末端结构域共同折叠，使 IFM 对应的残基远离结合位点。不幸的是，由于难以记录 NavPaS，因此无法定义 NavPaS 结构的功能状态。

为了剖析 Nav 通道的 EMC，已采用各种策略将通道锁定在不同状态。通过将 VSDIV 和相邻 S5I 上的八个残基从 Nav1.7 移植到 NavPaS 的支架上，产生了嵌合体。嫁接的 VSDIV 中的 S4 段比原始 NavPaS-VSDIV 中的 S4 段高一圈。与 α-蝎子毒素 AaH2 结合后，两个 GC 残基被转移到胞质侧。类似地，大鼠 Nav1.5 的 S4IV 片段在另一种蝎毒素 LqhIII 的存在下也向下移动了两个 GC 残基。

在这里，该研究报告了功能性 Nav1.7 变体的基于结构的工程，该变体表现出对激活的显著右移电压依赖性。VSDI 处于完全下降状态的这种变体与 WT Nav1.7 的结构比较揭示了 VSDI 和 VSDII 的多模式构象变化，这些变化通过相邻片段之间的串扰传播到细胞内门控。发现 S3I 片段上的保守 WNФФD 基序（Ф 表示疏水残基）可稳定 VSDI 的向下构象。总之，该研究为单链电压门控离子通道的机电耦合机制提供了重要的见解，并为许多疼痛相关突变提供了分子解释，这些突变的致病机制无法从先前报道的 Nav 结构中揭示。

转自： iNature

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