Nucleic Acids Res | 简单快速低成本，温州医科大学丁春明/金胜男首次实现了羟基末端DNA底物的直接腺苷酰化

5'-腺苷酸化寡核苷酸 (AppOligos) 广泛用于下一代测序 (NGS) 应用中的单链 DNA/RNA 连接，例如 microRNA (miRNA) 分析。AppOligo 接头和目标分子（如 miRNA）之间的连接不再需要 ATP，从而最大限度地减少潜在的自连接并简化文库制备程序。AppOligos 可以通过化学合成或酶促修饰来生产。然而，通过化学合成的腺苷酸化效率低且成本高，而酶促修饰需要预磷酸化底物和额外的纯化。

2022年7月12日，温州医科大学丁春明和金胜男共同通讯在Nucleic Acids Research（IF=19）在线发表题为“Direct adenylation from 5′-OH-terminated oligonucleotides by a fusion enzyme containing Pfu RNA ligase and T4 polynucleotide kinase ”的研究论文，该研究克隆并表征了由超嗜热古细菌 Pyrococcus furiosus 中的 PF0353 基因编码的 Pfu RNA 连接酶。

该研究进一步设计了含有 Pfu RNA 连接酶和 T4 多核苷酸激酶的融合酶。一种融合酶 8H-AP 是热稳定的，可以直接将 5'-OH 末端的 DNA 底物催化为腺苷酸化产物。新发现的 Pfu RNA 连接酶和工程融合酶可能是AppOligos 应用的有用工具。总之，该研究成果首次实现了羟基末端DNA底物的直接腺苷酰化，为DNA的腺苷酰化修饰提供了一种更加简单、快速、低成本的全新工具，相比于传统的腺苷酰化酶具有更加明显和优势的应用价值和商业转化潜力。

5'-腺苷酸化寡核苷酸 (AppOligo) 接头或 DNA 接头在文库制备过程中用于小 RNA 和单链 DNA (ssDNA) 的下一代测序 (NGS)。对于小 RNA 测序文库制备，使用 T4 RNA 连接酶 1 或截短的 T4 RNA 连接酶 2 将 5' 预腺苷酸化接头连接到 RNA 分子的 3' 末端，无需添加 ATP，从而无需将底物 RNA 去磷酸化以避免不需要的自连接副产物。

AppOligo 可以通过化学合成或酶促修饰来生产。化学合成方法使用 5'-磷酸化寡核苷酸与预活化的 5'-单磷酸腺苷 (AMP) 在溶液或固体支持物上的反应，该过程转化效率较差，同时还需要阻断 3 '底物末端以防止自连接。因此，需要通过高效液相色谱 (HPLC) 和聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE) 等方法进行额外纯化，以去除未转化的底物。

酶促修饰依赖于 DNA 或 RNA 连接酶将 AMP 残基转移到寡核苷酸的 5'-磷酸酯上的能力。腺苷酸化的 DNA 或 RNA 是连接反应中的中间体，通常不会在连接过程中积累。目前生产 AppOligos 的酶促方法需要通过不提供受体或引入含有与 5'-磷酰 DNA 供体位点相反的错配核苷酸的模板来中断连接反应以产生 AppOligo 中间体。另一种酶促方法是使用不依赖模板的 RNA 连接酶或环化酶，例如 Mth RNA 连接酶 (Mth Rnl)、TS2126 RNA 连接酶或大肠杆菌 RNA 3'-磷酸环化酶 (RtcA)，将磷酸化的 DNA 或 RNA 直接地催化为腺苷酸化产物。然而，这些反应需要预磷酸化的寡核苷酸和高浓度的 ATP 以防止模板环化。

在本研究中，从 Pyrococcus furiosus 中鉴定了一种名为 Pfu RNA 连接酶 (Pfu Rnl) 的酶。Pfu Rnl 是热稳定的，并且对磷酸化的 DNA 或 RNA 寡核苷酸底物显示出高腺苷酸化效率，同时没有明显的 DNA 连接活性。该研究还通过将 Pfu Rnl 与 T4 多核苷酸激酶 (T4 PNK) 融合来设计融合酶。融合酶具有磷酸化和腺苷酸化活性，可在单一反应中高效地将 5'-OH 末端的 DNA 寡核苷酸转化为腺苷酸化产物。

总之，该研究成果首次实现了羟基末端DNA底物的直接腺苷酰化，为DNA的腺苷酰化修饰提供了一种更加简单、快速、低成本的全新工具，相比于传统的腺苷酰化酶具有更加明显和优势的应用价值和商业转化潜力。

丁春明研究员和金胜男研究员为本论文的通讯作者，博士后杨政权和2018级硕士研究生张成良为本文的共同第一作者。该研究得到了温州市科技项目、浙江省博士后择优资助项目、国家自然科学基金项目、浙江省新苗人才项目、浙江省高校高水平创新团队和浙江省医学技术一流学科（A类）的支持，并在检验医学教育部重点实验室的支持下完成。

转自： iNature

如有侵权，请联系本站删除！