今天和大家分享的是一篇于2021年12月在Cell Death & Disease'上发表的文章'Comprehensive transcriptomic characterization reveals core genes and module associated with immunological changes via 1619 samples of brain glioma'。作者运用WGCNA(加权基因共表达网络分析)找出临床表型相关且与免疫功能有关的hub基因，再运用LASSO建模，并计算样本的riskscore。然后作者发现该riskscore在病理特征、基因组突变、预后、肿瘤微环境等方面具有差异性的意义，并做出了合理的分析解释，该riskscore评分对于胶质瘤3的临床及背后的生物学机制研究具有指导性意义。最后作者落脚于当下火热的免疫治疗，发现riskscore的高低分组在免疫治疗应答的差异性，提出该riskscore可能有助于优化胶质瘤的免疫治疗，为胶质瘤的精准治疗提供了新的策略。该文章具体是怎么实现的呢，我们一起来学习一下吧~
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文章背景
一、胶质瘤是由胶质细胞或前体细胞产生的肿瘤，占中枢神经系统（CNS）恶性肿瘤的80%，通过手术切除、放疗和化疗治疗，患者的预后仍然惨淡。胶质母细胞瘤（WHO4级）患者的中位生存期在14.6～17个月之间。胶质瘤迫切需要新的治疗方法。
二、分子特征在胶质瘤的分类分型中扮演者越来越重要的角色，该文章是依据2016年WHO中枢神经系统肿瘤的分级进行研究的，在 2016 年 CNS WHO 分类中，胶质瘤根据组织学和分子特征进一步分类，lower-grade gliomas(LGG), isocitrate dehydrogenase-mutant (IDH-mutant) and 1p/19q-codeleted; LGG, IDH-mutant without 1p/19q-codeleted; LGG,IDH-wildtype; glioblastomas (GBM), IDH-mutant; and GBM, IDH-wildtype。同时胶质瘤中报道了一系列关键的基因改变，包括MGMT启动子甲基化、EGFR扩增和MET基因融合 。（目前最新版的分类是21年WHO分类，较2016年的分类分子特征更为重要，感兴趣的小伙伴可自行百度）
三、免疫治疗在肿瘤治疗中扮演着越来越重要的角色，甚至在有的癌种中发挥了颠覆性的作用。但免疫治疗仍面临巨大的挑战，其疗效具有不稳定性。
由于血脑屏障及胶质瘤自身的特点，免疫治疗在胶质瘤中的应用面临巨大挑战，但仍有大量针对胶质瘤，尤其是胶质母细胞瘤（GBM）的免疫治疗临床试验已经完成或正在进行，多项相关研究已显示出它们在胶质瘤治疗中的巨大潜力。
四、肿瘤微环境（TME）在肿瘤的发生和发展中起着举足轻重的作用。除了癌细胞，TME是由许多非恶性细胞形成的，包括免疫细胞。胶质瘤相关小胶质细胞/巨噬细胞(GAM)是胶质瘤TME中功能最多的细胞，约占总细胞群的30-50%。在神经胶质瘤中，GAM更可能具有抗炎和促肿瘤发生表型，这会增强神经胶质瘤的侵袭、血管生成、肿瘤生长并有助于免疫抑制性TME。
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数据来源及流程图
1）CGGA:
325 samples for mRNAseq_325 dataset
693 samples for mRNAseq_693 dataset
286 samples for WEseq_286
2）TCGA:
RNA sequencing data (702 samples)
somatic mutation, and copy number alterations (CNAs) data (646 samples)
3）An open single-cell sequencing dataset of glioblastomas
4）病理组织（来源于CGGA）
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成果展示
1.通过 WGCNA 和 LASSO 分析构建OS 的预后风险特征。
作者在CGGA的一个数据集中通过WGCAN得到5个模块，并于胶质瘤分类这个临床特征进行相关性比较，发现5个模块都与胶母IDH野生型有相关性，并选取蓝绿色和黄色这2个模块（图A）。选择MM>0.8和GS>0.2进一步筛选，并可视化其在模块中所占的比例（图B、图C）。再以筛选后的基因进行GO和KEGG富集分析，和TRRUST数据库中的上游调节子分析，发现蓝绿模块中筛选出的基因与免疫功能高度相关。（图D、图E）。再通过进一步聚集筛选得到14个候选基因（图F、补充图S）。这14个基因与OS（总生存期）均有关（图G）。基于OS运用LASSO构建模型，最终得到5个重要的基因及其在模型中系数（图H）。
2.RISKSCORE评分与病理特征的关系
作者先在CGGA数据集中运用5个hub基因的表达量及相应的系数计算每个样本的riskscore。并将该riskscore和已知的胶质瘤病理特征进行相关性分析，发现该评分与年龄、KPS评分、病理分级、IDH是否突变等胶质瘤病理特征具有相关性，且年龄越大，riskscore越大，KPS越小risks core越大、病理分级越高riskscore越高等等，即riskscore 与已知的表现为恶行的病理特征正相关（图A）。同时作者比较了该评分在胶质瘤四分型（图B），CpG岛甲基化（图C），细胞周期（图D），侵袭评分（图E）的关系，均发现riskscore与已知的恶行表型正相关。同时其在TCGA数据集中有着相同的结果（补充图S）。说明该模型的稳健性及临床实用性。
3.CGGA 和 TCGA 数据集中高危组和低危组之间基因组改变的比较
作者运用CGGA和TCGA中胶质瘤的基因组数据集在riskscore高低分组之间进行比较，发现高低分组之间的基因组改变有差异，从基因组层面印证了riskscore的意义,也为下面免疫治疗分析进行了铺垫。
4.RISKSCOR的预后价值
作者先在CGGA数据集中以riskscore的中位值进行分组，发现高低风险组之间的OS具有差异（图A）。同时发现在不同病理分级，不同分子特征下riskscore的高低分组同样具有差异（图B、图C），接着作者用ROC曲线（图D），单因素的COX分析（图E），诺莫图（图F），校准曲线（图G）评价了该模型的准确性，重要性，同时在TCGA数据集有着相同的效果（补充图S）。
图S
5.与risks core具有相关性基因的富集分析
作者找到与riskscore具有相关性的基因（图A），发现与riskscore正相关基因的富集分析显示，随着risks core的增加，免疫相关活动在增强。(图B、C)。同时发现riskscore与11种类型免疫活动中的10种正相关(图D)。在TCGA数据集中有着相同的结果（补充图S）。
6.RISKSCORE与肿瘤微环境之间的关系
作者先在CGGA数据集中运用ESTIMATE算法计算出基质系数，免疫系数，肿瘤纯度与riskscore之间的关系（图A），印证了随着riskscore的增加，免疫相关活动在增加。同时分析了10中免疫细胞与riskscore的相关性（图B），根据之前riskscore增加免疫活动增强及文章背景所提到的肿瘤相关巨噬细胞，作者选取巨噬细胞进行进一步的分析，通过一个公开的单细胞数据作者发现5个hub基因主要在巨噬细胞中表达（图C），对riskscore高，促癌，免疫评分高的的原因进行了合理的解释。接着作者通过巨噬细胞的marker及其促癌和抗癌的marker分别与riskscore进行相关性分析发现确实是risks core越高，促癌的巨噬细胞越多(图D)。然后作者还用免疫组化技术在病理标本上进行了佐证(图E、图F、图G)。TCGA数据集中有着相同的结果（图S）
7、riskscore和免疫治疗反应之间的关系
作者探索了免疫检查点与riskscore之间的相关性，发现TIM3、PD-1和PD-L1正相关（图A）。作者用TCPA数据库中PD-L1在高低风险组中表达量的不同，病理组织中TIM3表达量的不同进行了佐证(图B,图C)。接下来作者用TIDE算法推断出样本对免疫检查点治疗的反应，然后发现高风险组中免疫检查点治疗疗效相对于第风险组较差(图E)，同时查阅相关文献用高风险组中更多的PTEN基因缺失、更高的PI3K-AKT通路活性进行合理解释(图F、图G)。同时作者发现免疫检查点治疗有无应答和riskscore高低分组之间有着相同通路表达差异(图H)。总之高风险组的胶质瘤对免疫检查点治疗反应较差。
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小结
作者首先通过WGCNA找到hub基因然后运用LASSO构建模型，该模型在3个独立数据集的1619个样本中面对不同的病理和分子亚组有着较好预后预测，同时与恶行表型和体细胞改变有相关性，说明该模型有着较高稳健性、准确性和临床应用价值。同时作者通过一个公开的单细胞测序数据分析推断出高危组中胶质瘤相关小胶质细胞/巨噬细胞相对富集以进行合理解释。最终作者落脚于当下很热的免疫检查点治疗（ICB）,提出该模型可能有助于优化胶质瘤的免疫治疗。文章条理清晰，数据充分，推断合理，值得学习。
转自：科研人直通车
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