在上期 《转录调控专题1》中为大家介绍了转录组在肉类风味品质研究中的应用，旨在如何利用转录组筛选影响肉质口感的关键基因。除了肉质品质研究外，动物营养、动物免疫调节、动物疾病等多种难题也是优良品种产业化发展道路中的拦路虎。
从大量的文章中不难发现，宿主肠道与肠道微生物间的动态平衡是保障动物生长及发挥潜在生产性能的关键。当肠道内动态平衡紊乱时，宿主就会发生炎症反应，触发免疫反应，促进免疫相关基因上调表达；饲料、益生菌、抗生素等可影响肠道微生物组成，调节免疫过程，恢复因疾病导致的肠道微生物菌群失调。因此，以“微生物群—肠—脑” 轴、“微生物群—肠—肝脏”轴建立宿主肠道与肠道微生物之前的协作关系，为动物疾病预防、营养生长、抗病品种选育提供新的视角。
16S rDNA扩增子测序可从物种出发解释肠道菌群失调、恢复导致的疾病发生和病态逆转过程；转录组测序可获得疾病发生时，宿主产生的免疫激活和静息机制。转录组和关联又可碰撞出怎样的火花？本期小编就用一篇7+的合作项目文章，介绍如何通过这两个组学探究益生菌对肉鸡亚临床坏死性肠炎的缓解机制。
题目：膳食益生菌补充剂以微生物依赖性方式抑制家禽鸡的亚临床坏死性肠炎
发表时间：2022年3月
发表期刊：Frontiers in Immunology
影响因子：7.561
合作单位：四川农业大学
研究背景
鸡肉是人类动物蛋白质的主要来源，而坏死性肠炎是家禽业中的一种肠道细菌性疾病，会使肉鸡出现猝死且死亡率较高。更普遍的亚临床坏死性肠炎（SNE）虽没有较高的死亡率，但其潜在伴随的产气荚膜梭菌（CP）会引发人类食源性疾病。研究报道，益生菌可以改善宿主肠道菌群的组成，维持肠道内稳态，是潜在的预防肉鸡出现亚临床坏死性肠炎的有效防御策略。然而益生菌的作用机制以及作用过程中哪些肠道微生物具备这种功效的研究仍不清晰。本篇文章的主要目的是：研究益生菌的潜在机制，并通过肠道—肝脏轴减少SNE对肠道健康的负面影响。
研究方法
从商业孵化场购买180只一日龄雄性仔鸡，随机分为3组，每组6个重复，每个重复10只鸡，一个重复放在同一只笼子中饲养。将3组仔鸡分别构建3种模型：
（1）健康组（NC）；
（2）感染亚临床坏死性肠炎组（PC）；SNE阳性对照，构建SNE模型
（3）B. licheniformisH2组（BL）：口服B. licheniformisH2，并进行SNE诱导。
实验结束后，从每个重复中随机选择一只仔鸡禁食12h后称重，并一段时间后静脉放血用于测定血清中的免疫球蛋白和细胞因子含量。之后从每只肉鸡中取出右侧胸腺、脾脏、两份肝脏样本，其中一份肝脏用于转录组检测。收集回肠和盲肠内容物用与微生物菌群检测。
Tips
B. licheniformisH2：从健康肉鸡回肠中分离的地衣芽孢杆菌 H2，一种益生菌。
研究思路
研究结果
01
病理切片和生理指标测定表明地衣芽孢杆菌 H2可抑制产气荚膜梭菌（CP）和亚临床坏死性肠炎（SNE）诱导的炎症增殖
BL组肉鸡回肠中产气荚膜梭菌相对丰度显著低于PC组。3组肉鸡的回肠、肝脏病理切片表明PC组的回肠存在大量淋巴细胞浸润、肠上皮细胞坏死脱落、肝细胞明显肿胀和颗粒变性；BL组中回肠轻度损伤、轻微出血现象和轻度的颗粒变性（图1A，B）。说明地衣芽孢杆菌H2可明显改善SNE诱导的病理损伤。
图1 地衣芽孢杆菌H2抑制CP和SNE诱导的炎症增殖
*A：产气荚膜梭菌（CP）在PC和BL组中的丰度；B：NC、PC、BL组回肠、肝脏切片呈像。a~f：回肠呈像；e~i：肝脏呈像
02
地衣芽孢杆菌H2增强肠道屏障功能、上皮细胞更新和提高免疫力
根据结果1的结论：SNE可诱导肠上皮细胞损伤。为进一步验证地衣芽孢杆菌H2可能具备的修复能力，对免疫和修复相关基因的丰度观测发现：CLDN-1、CLDN-3、ZO-1、ZO-2等紧密连接蛋白以及m-TOR等上皮细胞更新相关基因在BL组回肠中的丰度显著高于NC组和PC组。说明服用地衣芽孢杆菌H2后可显著改善回肠肠道屏障完整性并促进上皮细胞更新。同时，BL组可改善由SNE导致的IL-2、IFN-g、IL-8等细胞因子和IgG、IgA免疫球蛋白在不同组织中出现的含量降低现象。整体说明：地衣芽孢杆菌H2可增强肉鸡回肠的肠道屏障并促进上皮细胞更新。
图2 肉鸡回肠、盲肠组织中CLDN-1、CLDN-3、OCLN、ZO-1、ZO-2、mTOR mRNA丰度
03
转录组揭示SNE诱导和喂食地衣芽孢杆菌H2后肝脏基因表达谱
表型和生理指标探索完成，接下来作者就基于转录组的结果，在分子层面上探讨喂食地衣芽孢杆菌H2对肉鸡肝脏组织、回肠组织的调控。
对肝脏组织提取RNA进行转录组测序并对获得的基因进行差异分析，在PC-vs-NC、BL-vs-NC、BL-vs-PC组中分别获得77，69，44个差异表达基因（图3A）。对差异基因进行GO富集分析，发现这些基因可能参与免疫应答、免疫球蛋白结合、MHC蛋白结合、抗原结合、ATP生物合成等过程。差异基因的KEGG富集结果指示这些基因可能参与调节ErbB信号途径、代谢途径、脂肪酸降解、MAPK信号途径、PPAR信号途径和细胞周期等通路。对三个比较组获得的差异基因绘制韦恩图并结合基因的注释信息发现，与免疫反应和代谢过程密切相关的基因（MHCIY、SCD、ALPP）仅出现在NC -vs-PC组和PC-vs-BL组。与免疫反应密切相关的基因（LOC771804、FCER1G、LOC107050390、CHIR-B3）仅在NC -vs-PC组中显著差异表达，在其余两个比较组中均未显著差异表达（图3B）。说明SNE可导致肝脏免疫、代谢相关基因异常表达，服用地衣芽孢杆菌H2可在一定程度上改善这一现象。
图3 肝脏转录组数据分析
*A：不同比较组差异基因柱状图；B：不同比较组差异基因韦恩图
由于免疫反应是一种耗能过程，对能量代谢和相关基因丰度进一步分析，发现地衣芽孢杆菌H2处理可降低肉鸡回肠和盲肠中耗能相关基因PGC-1a丰度，增加抑制细胞基因SCD1表达量。同时，回肠中葡萄糖和氨基酸转运蛋白相关基因的丰度也得到增强（图4）。
图4 PGC-1a、SCD1、葡萄糖、氨基酸转运蛋白相关基因在盲肠和回肠中mRNA丰度信息
04
16S rDNA揭示地衣芽孢杆菌H2对肉鸡肠道微生物菌群的影响
肠道屏障完整性、营养吸收、代谢和免疫离不开宿主肠道微生物菌群的调控作用。为进一步探究地衣芽孢杆菌H2对SNE诱导后的肉鸡肠道菌群影响，作者借助16S rDNA扩增子序列分析揭示该菌对肠道其他菌群的调控。
稀释曲线（rarefaction curve）表明测序深度已基本覆盖到样品中所有的物种。α多样性分析中各类型指标参数，如Chao1指数、Shannon指数、ACE指数、Simpson指数、Good’s coverage指数在BL组和NC组的回肠和盲肠组织中更相似（图5A~D）；β-多样性分析进一步表明NC组和BL组肠道微生物菌群的相似性较高，但与PC组的相似性较低（图5E、F）。3组样本OUT韦恩图结果表明：地衣芽孢杆菌治疗后，SNE诱导的回肠和盲肠中独特的OUT数量减少（图6A，B）。
图5 细菌α多样性和PCoA分析
*A、C、E：回肠组织；B、D、F：盲肠组织
图6 OUT韦恩图和门、属水平细菌分布堆叠图
*A、C、E：回肠组织；B、D、F：盲肠组织
对回肠组织中微生物群落门水平再分析发现，相比于NC组，PC组中厚壁菌（Firmicutes）、变形菌（Proteobacteria）、氯屈曲菌（Chloroflexi）的相对丰度降低，氧致发光菌（Oxyphotobacteria）、拟杆菌（Bacteroidetes）、梭杆菌（Deinococcus-Thermus）相对丰度增加，BL组可扭转这些微生物的变化趋势。盲肠组织微生物群落门水平结果表明，相比于NC组，PC组中拟杆菌（Bacteroidetes）、软壁菌门（Tenericutes）、变形杆菌（Proteobacteria）等相对丰度水平较低，厚壁菌门（Firmicutes）相对丰度较高，这些变化在BL组中得到了缓解。同样，在更精细的属水平上进行对比也发现部分在PC组中失调表达的微生物可在BL组中得到缓解，而且BL组回肠组织中乳酸杆菌（Lactobacillus）丰度较高，分段丝状细菌（Candidatus_Arthromitus）丰度下降。Metastats分析表明回肠和盲肠细菌组成在门和属水平上存在显著差异。LEfSe分析组间菌群差异分析表明，回肠中PC组具备更多的差异生物标记物，其次是BL组和NC组。16S rDNA扩增子结果整体表明，NC组和 BL组的肠道微生物菌群存在更高的相似性，暗示地衣芽孢杆菌H2处理可逆转SNE导致的肠道菌群失调（图6）。
为了解肠道菌群在宿主具体具备的生物学功能，以及NC组、PC组、BL组微生物群落趋势，对微生物群功能进行预测，发现与化学异样、发酵、尿素分解、木聚糖分解、有氧化学异养等功能有关的细菌在NC组和BL组具备高度相似性且均与PC组不同（图7）。种种结果表明，相比于PC组与NC组或PC组与BL组，BL组与NC组肠道微生物菌群特征存在更高的相似性。
图7
05
转录组+16S rDNA共分析揭示基因丰度变化对微生物菌群特征影响
最后，就是文章的高潮部分，对两组学数据进行整合，揭示宿主基因丰度与肠道微生物群落间的相互作用，使整个微生物群-肠-肝脏轴调控机制形成一个闭环。
将通过肝脏转录组数据筛选出的7个参与代谢和免疫反应差异表达基因，和16S rDNA扩增子测序得到的在属水平丰度最高的100个细菌进行Spearman相关系数分析以揭示肠道微生物群落和肝脏基因间潜在存在的关联（图8）。发现细菌与免疫相关基因存在高度正相关关系，与代谢相关基因存在显著负相关关系。
为揭示更详细的基因与微生物群落间的关系，分析16S rDNA结果获得的代表性细菌，如拟杆菌属（Bacteroides）、乳酸杆菌属（Lactobacillus）、巨单孢菌属（Megamonas）、考拉杆菌属（Phascolarctobacterium）等与基因的相关性，发现：盲肠中，与代谢基因正相关，与免疫基因负相关的拟杆菌属、乳酸杆菌属、未鉴定的瘤胃球菌属、氢化细菌属、梭状芽孢杆菌属在PC组中下调表达（NC-vs- PC），在BL组中得到缓解（PC-vs-BL）；与代谢基因负相关，与免疫基因正相关的巨单孢菌属（Megamonas）、另枝菌属、考拉杆菌属（Phascolarctobacterium）在PC组中上调表达，在BL中下调表达；回肠中，与免疫基因正相关，代谢基因负相关的魏斯氏菌（Weissella）、粪杆菌属（Faecalibacterium）、罗氏菌属（Rothia）、巨单孢菌属（Megamonas）、梭菌属（Fusobacterium）、寡养单胞菌属（Stenotrophomonas）在PC组中丰度更高，BL组中丰度较低。表明SNE处理后会导致回肠，盲肠肠道微生物菌群丰富变化，提升肝脏免疫相关基因的表达，促进免疫过程的发生。地衣芽孢杆菌H2可降低肝脏基因表达抑制免疫反应，并通过微生物菌群促进生长和代谢过程。
图8 免疫，代谢相关差异基因与属水平丰度最高的微生物相关性分析热图
*A：回肠组织；B：盲肠组织
小结
本文整体结构十分清晰，基于表型观测、细胞因子和免疫球蛋白丰度检测发现SNE处理可导致肉鸡产生免疫反应，使用地衣芽孢杆菌H2可缓解免疫过程。之后即分别从转录组组角度和微生物角度探讨SNE处理导致免疫、代谢相关基因、物种组成的出现异常变化，地衣芽孢杆菌H2处理可改善这种异常表达，尽可能使其恢复到正常水平。最终基于转录组筛选出的关键基因和16S rDNA测序得到的丰度较高的物种信息，计算两者间丰度的Spearman相关系数，阐明微生物群落与宿主基因调控中具备的潜在关联。
参考文献
Zhao Y, Zeng Y, Zeng D, et al. Dietary Probiotic Supplementation Suppresses Subclinical Necrotic Enteritis in Broiler Chickens in a Microbiota-Dependent Manner. Front Immunol. 2022 Mar 18;13:855426.
转自：基迪奥生物
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