康奈尔大学：Caspase-11与NLRP3的相互作用增强了NLRP3炎症小体的非典型激活

背景

鼠caspase-11及其人类直系同源物caspase 4和5是LPS的细胞质受体。Caspase-11通过裂解gasdermin D (GSDMD)协调脓毒症模型中协调防御革兰氏阴性菌和致死性，GSDMD 执行受感染细胞的焦亡并在内毒素休克中损伤组织。Caspase-11还介导高度炎性NLRP3炎症小体的非典型 (NC)激活，从而引发Caspase-1裂解和白细胞介素-(IL)-1β的产生。Caspase-11不直接裂解IL-1β，而caspase 1和11均裂解GSDMD。NLRP3炎症小体NC激活的潜在机制包括caspase-11与caspase-1的异二聚化以及caspase-11介导的依赖GSDMD的细胞扰动 (通过细胞内在途径发挥作用)。

简介

2022年4月29日，来自美国康奈尔大学的Julien Moretti及其团队在Nat Immunol (IF: 20.479)杂志上发表名为Caspase-11 interaction with NLRP3 potentiates the noncanonical activation of the NLRP3 inflammasome的研究[1]。

主要结果

mRNAbac和LPS激活caspase-11和炎症小体。  我们研究了吞噬革兰氏阴性菌后骨髓源性巨噬细胞 (以下简称巨噬细胞)中NLRP3炎症小体的NC激活。我们观察到活的和死的大肠杆菌有相似的溶酶体定位。为了避免复制因子或毒力因子的复合效应，我们使用了非致病性大肠杆菌K12菌株DH5α的胸苷营养缺陷型。活大肠杆菌引起caspase-11、caspase-1、GSDMD和IL-1β的裂解，并通过电子显微镜观察和通过乳酸脱氢酶 (LDH)释放测量诱导细胞焦亡 (图1a、b、c)。这些反应反映了炎症小体效应子功能，在对被杀死的大肠杆菌的反应中显著受损，所述大肠杆菌具有LPS但缺乏vita-PAMP mRNAbac，尽管活的或被杀死的大肠杆菌表现出类似的炎症小体原NLRP3以及IL-1β、caspase-1和caspase-11的形式的表达 (图1a，c)。递送mRNAbac或细菌RNA (RNAbac，其中含有1% mRNAbac)，同时吞噬被杀死的大肠杆菌，无论RNAbac是从革兰氏阳性细菌还是革兰氏阴性细菌中分离出来，均恢复了caspase-11和GSDMD裂解 (图1a，c)，并将IL-1β分泌和细胞焦亡恢复到与活大肠杆菌诱导的水平相当的水平 (图1a，c)。真核生物mRNA不能做到这一点。在所有刺激条件下，炎症体非依赖性IL-6和肿瘤坏死因子 (TNF)的产生相似 (图1a，c)。利福平处理大肠杆菌抑制了RNAbac合成，降低了caspase-11、caspase-1和IL-1β的裂解，同时保留了约70%的细菌活力 (图1d，e)。

图1. 细菌mRNA和刺激性LPS都是caspase-11和非典型性炎症小体激活所必需的

Caspase-11是NLRP3炎症小体组装所必需的。  接下来，我们研究了caspase-11对响应革兰氏阴性菌的NLRP3炎症小体NC激活的需求。在用活细菌或杀死的细菌加RNA刺激后，Casp11-/-巨噬细胞中的ASC寡聚化和所有炎症小体效应子功能受损 (与野生型巨噬细胞相比) (图5a-c)，无论是在刺激后早期 (8h)还是晚期 (16h)评估ASC寡聚化 (图5b)。在用活大肠杆菌刺激后8小时，在Casp1-/-巨噬细胞中检测到新生ASC寡聚体，但在用活大肠杆菌或被杀死的大肠杆菌加RNAbac刺激后16小时未检测到 (图5a，b)，表明在不存在Casp1的情况下无法产生稳定的更高阶ASC聚集，与先前的观察结果一致。在用活细菌刺激后16h，在Casp11-/-或Casp1-/-巨噬细胞中也未检测到ASC斑点 (图5d)。在野生型、Casp11-/-或Casp1-/-巨噬细胞中，活的、被杀死的或被杀死的大肠杆菌加上RNAbac类似地诱导了Pro-IL-1β的表达 (图5a)，尽管我们注意到Casp11-/-巨噬细胞中的pro-caspase-1表达和Casp1-/-巨噬细胞中的pro-caspase-11表达代偿性增加，而GSDMD和ASC表达在所有基因型中相似 (图5a)。用吞噬杀死的大肠杆菌递送 poly (dA:dT) 在 Casp11-/- 巨噬细胞中引起 ASC 寡聚化 (图5c)，表明Casp11-/-巨噬细胞在ASC寡聚化中没有一般损伤。然而，与组装的NLRP3炎症小体对caspase-11激活的特定要求一致，只有由用RNAbac杀死的大肠杆菌而不是poly (dA:dT)触发的ASC寡聚化伴有caspase-11、caspase-1、pro-IL-1β或GSDMD的裂解 (图5c)。

图5. Pro-caspase-11 蛋白是 NLRP3 炎症小体组装所必需的，以响应无毒革兰氏阴性菌

Pro-caspase-11 SCAF与NLRP3 LRR和PYD相互作用。  为了确定对它们的相互作用很重要的 NLRP3 和 pro-caspase-11 的结构域，我们在 HA 标记的 NLRP3 的 293T 细胞全长 (NLRP3FL) 和截短突变形式 (NLRP3ΔPYD、NLRP3ΔLRR、NLRP3ΔNACHT ΔPYD、NLRP3ΔNACHT ΔLRR) 中表达，以及 FLAG 标记的催化失活 caspase-11 (C254A) 的全长 (casp11C254A FL) 和截短突变形式 (casp11C254A ΔSCAF、casp11C254A ΔCARD)。与 casp11C254A FL 和 casp11C254A ΔCARD 相比，HA-NLRP3FL 没有与 casp11C254A ΔSCAF 有效地共免疫沉淀，即使当它以高四倍的浓度加载时 （图 8a），表明与 LPS3 结合的 caspase-11 的 CARD 结构域， caspase-11 与 NLRP3FL 共免疫沉淀不是必需的，而另一个 caspase 结构域是必需的，在本文称为支架 (SCAF) 结构域。FLAG-casp11C254A FL 的反向免疫沉淀（IP）证实了这些结果，其中 NLRP3 FL 不能与 casp11C254A ΔSCAF 共免疫沉淀，与其与 casp11C254A FL 的共免疫沉淀相反（图 8a）。

图8. Pro-caspase-11 NLRP3 相互作用由 caspase-11 SCAF 结构域和 NLRP3 LRR 和 PYD 结构域介导

结论及展望

在此，我们表明巨噬细胞对LPS和mRNAbac的同时胞质检测同时参与了NLRP3和caspase-11，并使它们能够相互作用和相互依赖地相互激活。活革兰氏阴性菌的巨噬细胞吞噬作用诱导caspase-11与NLRP3在dTGN处共定位，早在3h就有前caspase-11 NLRP3相互作用。caspase-11前体和NLRP3可通过中间蛋白直接或间接相互作用。mRNAbac和LPS一起 (而非各自单独)在巨噬细胞吞噬细菌后的胞质溶胶中检测到的浓度相当时，在任一受体激活上游和NLRP3-ASC寡聚化之前触发促caspase-11 NLRP3相互作用。只要还存在与NLRP3结合的RNAbac，LPS与caspase-11结合而不是刺激caspase-11是必要且充分的。虽然ASC对于前caspase-11 NLRP3相互作用不是必需的，但是NLRP3和ASC (一种组装的NLRP3炎症小体)都是LPS激活前caspase-11所必需的，这表明与NLRP3的上游相互作用允许LPS结合的前caspase-11被激活。反之，mRNAbac驱动的NLRP3炎症小体组装需要caspase-11蛋白，而非其活性，这也需要LPS，由于RNAbac制剂中潜在的LPS污染，这一要求可能被忽视。一旦组装，NLPR3炎症小体，而不是AIM2或NLRC4炎症小体，与LPS结合的caspase-11的激活有关。poly (dA:dT)并吞噬被杀死的大肠杆菌时，caspase-11前体未与AIM2相互作用。在NEK7和ASC募集到NLRP3时，NLRP3和caspase-11前体可能保留在单一复合物中，这可能解释了在组装NLRP3时caspase-11被激活的现象，但AIM2炎症小体未被激活。mRNAbac和LPS的胞质共检测如何促进caspase-11激活需要进一步研究。我们的发现表明，巨噬细胞中caspase-11激活的非互斥模式取决于胞质LPS检测的背景。在致病性革兰氏阴性菌入侵细胞期间，细菌毒力因子的同时表达触发了一种快速、非NLRP3依赖性模式。一种较慢的NLRP3依赖模式是由吞噬的革兰氏阴性菌中同时检测到mRNAbac触发的，且与毒力因子无关。

原文链接

https://www.nature.com/articles/s41590-022-01192-4

参考文献

1.Moretti Julien,Jia Baosen,Hutchins Zachary et al. Caspase-11 interaction with NLRP3 potentiates the noncanonical activation of the NLRP3 inflammasome.[J] .Nat Immunol, 2022, undefined: undefined.

转自：医学科研小坑

文章来源于生物医学科研之家 ，作者光影

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