今天想和大家分享的是一篇关于癌症起源的文章（Cell Rep，9.4233）。癌症很可怕，但比癌症更可怕的是癌症转移，癌细胞拥有无限的生长能力，增殖能力和转移能力。一旦发生转移，癌细胞就会侵入人体其他组织器官，导致器官衰竭甚至死亡。此外，在癌症转移发生后，很多癌症治疗方法都会受到限制，治疗难度大大提高。然而，现阶段研究对“转移细胞是如何产生的”这一问题尚不清楚。引起转移的细胞必须首先在原发肿瘤内获得促转移状态，再参与迁移机制，并最终在其他地方形成继发肿瘤块。那么这种促转移状态以及转移细胞又是如何产生的呢？就让我们一起带着这个问题开始今天的文献学习之旅吧。
日内瓦大学的科学家们通过寻找诱导最近表征的促转移状态，作为转移起源的替代物，并进一步探究细胞死亡诱导疗法是否会诱导人类结肠癌细胞的促转移状态。最终发现一类获得促转移状态的濒死细胞（PAME），并发现其拥有在体内形成远端转移的能力。这些PAME细胞表现出细胞因子风暴，内质网(ER)应激和核重编程能力增强等特点。PAMEs诱导邻近肿瘤细胞成为PAME诱导的迁移细胞(PIMs):其同样拥有高度迁移能力，重现细胞因子风暴并增强PAME迁移（图解摘要）。因此，研究者认为濒死细胞可以通过内质网应激调节、转移重编程和细胞因子风暴获得促转移能力。
图解摘要
On the origin of metastases: Induction of pro-metastatic states after impending cell death via ER stress, reprogramming, and a cytokine storm
转移的起源:通过内质网应激、重编程和细胞因子风暴诱导细胞濒临死亡后的促转移状态
1.濒死细胞活下来，就成了我：PAME
对异质结肠癌CC14细胞进行细胞致死STS处理（激酶抑制剂十字孢碱触发晚期凋亡细胞的存活），6 h后用凋亡抑制剂Q-VD-OPh + DIDS进行阻断（图1A-B）。仅用DMSO或BLOCK处理的细胞(对照组)不受影响(图1B)，而用STS处理的细胞100%死亡并出现凋亡表型(图1B-C)。STS + BLOCK处理 5天后部分PAMEs被挽救并出现增殖(图1C)。PAMEs经慢病毒转染后均为lacZ+，并经XGal染色鉴定(图1D)。而单独的BLOCK无效，PAMEs的迁移细胞数量增加12倍(图1D)。在其他结肠癌CC36，Ls174T， DLD1等细胞株中均可观察到相似现象(图1E-F）。将CC14 PAME lacZ移植到裸鼠中(图1H)，与DMSO/DMSO或对照(DMSO/BLOCK)组相比，肺远端转移瘤分别增加3.4倍和1.5倍(图1H)，表明存在内源性凋亡细胞的挽救现象。从CC14 PAME原发肿瘤中移植的细胞显示出2倍的迁移能力(图1I)，表明PAME后代在多次分裂后仍保持着较强的转移能力。
图1. PAMEs表现出稳定、增强的迁移和转移能力
2.凋亡阻断剂相关的多种药物诱导PAME
通过regorafenib和BLOCK处理4天后，细胞数量达到原来的30% - 40%。经过2天的恢复和扩展后，PAMEs REG显示出2.5倍的迁移能力(图1G)。此外，用非apocalyptic STS处理，然后在不含BLOCK的环境培养7天后，细胞的迁移能力提高4倍，其他临床相关化疗药物处理后，细胞迁移能力也表现出不同程度的增强(图1J)。
3. PAMEs中分泌性、干性和转移性重编程因子表达增强
研究者进一步对PAME-CC14（STS PAMEs）和对照细胞进行RNA-seq测序分析，在STS PAMEs中细胞因子信号转导、炎症/免疫反应和细胞外基质组织相关基因表达上调，有利于细胞因子风暴的形成。额外的qRT-PCR分析显示SNAIL1、ZEB1和VIM在PAMEs中升高2倍或更多(图2B)，提示在此过程中EMT能力增强。此外，所有被检测的结肠癌PAMEs都具有高水平表达的干细胞标记物NANOG/NANOGP8(图2B)，并且大多数也表达高水平的转移性重编程因子OCT4、SOX2和KLF4 (图2B)。
图2. PAME转录组分析和PIM诱导
4. PAMEs诱导邻近癌细胞成为高度迁移的PIMs
分别将RFP+CC14细胞与对照细胞和PAMEs共培养，相比对照组，与PAMEs共培养的细胞其迁移能力增加9倍(图2C-D)。被PAMEs诱导获得高度迁移能力的肿瘤细胞被称为PIMs (PAMEs诱导迁移细胞)。PAMEs GFP和PIMs RFP的基因表达分析表明PAMEs中上调的重编程/干性特征在PIMs中缺失(图2E)。然而，两种细胞在显著上调和显著下调的top基因中表现出明显重叠(图2E)。为测试PIM诱导扩散的可能性，研究者使用C11细胞进一步检测PIM (PIMs1)诱导更多PIM (PIMs2)的能力。PAMEs诱导的PIMs1被FACS分离，其迁移能力增加26倍(图3A-B)。此外，经PIMs1诱导后生成的PIMs2同样保持高度迁移能力，虽然这种能力稍低于PIMs1（图3C-D）。此外，研究者发现在迁移能力越强的细胞中，INSL4和IL32表达越高（图3E-F）。PIM诱导在传播过程中迁移能力逐渐下降。
5. PITS 分泌诱导PIM是一种常见现象
研究者预测PIM诱导会分泌细胞因子风暴(PITS)，因此进一步测试PAME培养基对PIM的诱导(图3G)。在研究者发现来自不同细胞甚至多个细胞的PAMEs培养基(CM)诱导的PIMs相比对照CM处理的同类型细胞均发生不同程度的增加 (图3H-J)。
图3. PIM诱导和条件培养基
6. PIMs与PAMEs关联并发生共同迁移
与对照组相比，将CC14 PIMs移植到裸鼠中并没有增加其转移能力(图3K)。因此研究者推测PIMs可能会帮助PAMEs转移。标记共培养物的延时照片分析显示PAME-PIM细胞的关联频率是对照-对照细胞的10倍(图4A和4B)。这种关联很密切，在共焦显微镜中出现黄色重叠区(图4C)。梭形细胞形态（通常与主动迁移有关）在20%的PAMEs中存在，但在对照细胞中非常少见(图4C)。与PIMs-RFP相关的PAMEs-GFP表现出这种表型的频率是单独PAMEs的两倍(图4C)。对24小时后穿过过滤器的细胞进行染色，当超过95%的细胞为单一细胞时，显示CC14 PAME-lacZ与PIM-AP混合后细胞比对照混合细胞增加2.5倍(图4D)，并且这种趋势可以保持4天。以上结果表明PAMEs-lacZ与PIM-AP的相关性比对照组lacZ、AP混合物增强4倍(图4D-E)。此外，与PAMEs单独培养或PAMEs- lacz与细胞分选后的PAMEs- GFP /AP共培养相比，PAMEs-PIMs共培养细胞的的迁移增加4倍(图4F)。PIM培养基对PAME迁移没有影响(图4G)。当PAME与PIM共同存在时的转移效率比PAME与PAME共同培养时提高1.8倍(图4H)。
图4. PAMEs/ PIM的关联和迁移及常见细胞因子风暴的识别
7. PIM和PAME转录组的相似性
与对照组相比，PAMEs和PIM存在显著交叠的差异表达基因，其中炎症反应、细胞因子活性、细胞迁移的正向调节以及分泌因子相关基因在PAMEs和PIM中同时上调，并且存在频繁的蛋白质互作(图4I-J)。此外，与对照组相比，12个细胞因子蛋白在CC14-PAME培养基中表达丰度增加2倍（图4K），表明PITS 含有多种细胞因子和分泌因子。
8. PITS与CXCL8、MIF、EGFR、COX2、IL32和INSL4的活性相关
CXCL8在PAMEs和PIM中上调，在蛋白质互作网络和细胞转移过程中发挥关键作用。研究者在CC14细胞中加入CXCL8配体后，其迁移细胞数量增加(图5A)。相比之下，CXCL1配体加入后迁移细胞数量下降 (图5A)。为抑制内源性CXCL8功能，研究者将一种CXCR1/CXCR2受体阻断剂添加到培养皿中，预处理1小时后发现PAMEs诱导的PIM迁移量减少2倍(图5B)。
AZD-5069是另一种CXCR2的拮抗剂，但AZD-5069处理后未观察到迁移变化(图5B)，表明CXCL8通过CXCR1发挥作用。由于0.1-1 ug/mL的CXCL8(图5A)不能表现出PITS的强度(图3G-H)，研究者进一步在PAMEs中测试其他上调因子的影响。ISO-1处理PAME诱导PIM后，PIM迁移率降低30%(图5B)。在PAME中AREG上调后迁移能力增加(图5A)，而用西妥昔单抗阻断其受体EGFR的活性会导致PIM迁移的减少(图5B)。
IL32和INSL在PAMEs和PIM中上调，参与迁移和侵袭调节过程。IL32诱导迁移能力增强(图5A)。在CC14细胞中，通过cDNA转导直接表达INSL4可使细胞的迁移行为增强2倍(图5A)，这与CXCL8无关。与CXCL8不同，在药理学上无法阻断INSL4作用(图5B)，而且由于其在PAMEs中的诱导作用非常高，因此难以充分抑制INSL4，这促使研究者构建CRISPR-Cas9双突变克隆，删除其启动子ATGs。在体外，INSL4和IL32突变体使迁移能力和远端转移能力显著下降(图5C)。
9. PAMEs和PIM显示单细胞定义的促转移状态
研究者先前的scRNA-seq工作分析识别出一类METSP(促转移细胞亚群，图5D)，CXCL8、INSL4和IL32在METSP中高表达 (图4J)。为进一步确定PAMEs和PIM是否表现出METSP促转移状态，研究者将在RNA-seq(也在scRNA-seq中检测到)中常见的PAME/PIM上调和下调基因映射到四个先前定义的scRNA-seq簇(图5D- E)。PAME/PIM上调基因主要在METSP中表达，而下调基因则映射到非METSP中 (图5E)。在PAME/PIM中上调且显著富集到METSP中的基因主要与浸润，细胞因子活性等生物学过程相关(图5F)。
图5.PAMEs和PIMs与多功能细胞因子风暴相关，并表现出促转移
10. PAMEs与内质网应激
METSP细胞内质网应激相关基因，如DDIT3(编码CHOP)、HSPA5(编码BIP)、ATF 等表达增强(图6A)。一致地，研究者发现在PAME-CC14和PAME-C11中，发生剪接的XBP1、DDIT3和HSPA5的表达水平有所提高(图6B)。鉴于内质网应激和转移之间的联系，研究者进一步测试高度内质网应激对驱动迁移能力的影响。经内质网应激诱导处理后的CC14和E3细胞中DDIT3和HSPA5表达升高，迁移能力降低(图6C，蓝条)。研究者进一步基于PERK抑制剂(PERKi;GSK2606414)测试内质网应激相关通路PERK-ATF4- CHOP对迁移的影响。PERKi处理增强其迁移能力，降低DDIT3和HSPA5表达(图6C和6D)， PERKi和内质网应激诱导处理相互平衡(图6C)。此外，迁移活跃的PAMEs-C11和PIM中内质网应激标记物水平降低(图6E)，这与迁移的CC14细胞中HSPA5下调一致，但其他METSP基因保持不变(图6E)。PERKi阻断PREK，进一步增强PAME-CC14和PAME-C11的细胞迁移(图6F-G)。
图6. 内质网应激调节PAME迁移能力
11. CHOP、NANOG和GLI参与PAMEs
CHOP是PERK的下游因子，研究者通过敲除DDIT3验证其对迁移的影响。DDIT3敲除后PAME细胞的迁移能力显著下降(图7A)。然而，除NANOG/P8和GLI1没有明显表达增加外，DDIT3敲除PAME中的PAME特征仍然存在(图7A)。因此，研究者推测CHOP对于转移性PAMEs重编程是必要的。研究者进一步直接测试NANOG的作用，发现NANOG在癌细胞中是由转移性重编程诱导以及增强转移状态所必需的，并与GLI1发挥协同作用。NANOG/NANOGP8敲除未观察到GLI1和CXCL8的上调以及转移能力的增强(图7B)。
上述结果提示GLI基因可能在内质网应激和转移性重编程/NANOG之间发挥关联作用。因此，研究者进一步探究内质网应激增强是否可以激活GLI1。内质网诱导处理后GLI1表达升高(图7C)。GLI1的表达导致NANOG/P8上调，IL32增强(图7C)，GLI3影响IL32和CXCL8，抑制INSL4(图7C)。因此，研究者认为主要是由GLI1，而不是GLI3负责调节PAME特征和内质网应激水平的反馈，以及DDIT3表达升高 (图7C)。
以上结果表明在被攻击后侥幸存活的人类结肠癌细胞，可以通过细胞重塑，诱导促转移状态。濒死细胞可以通过内质网应激调节、转移重编程和细胞因子风暴获得促转移能力。(图7D-E)。
图7. 通过CHOP、NANOG和GLI参与的PAMEs诱导转移发生
据报道，除非肿瘤过大，压迫到重要脏器以外，绝大部分癌症病人并不是直接死于原发肿瘤。然而，癌细胞转移会使脑，骨等重要器官收到侵害，数据显示90%的患者死于癌症转移。所以癌细胞的转移，对控制和治疗肿瘤是至关重要的。在本篇文章中，研究者将诱导最近表征的促转移状态作为转移起源的替代物。通过诱导濒死细胞并测试其转移、迁移能力，发现这些本应死亡的细胞会自我重新编程，然后呈现出更高的转移风险。此外，研究者还发现细胞濒死状态产生内质网应激，从而使PAME细胞得以发育以及细胞因子风暴产生。该研究为新的癌症转移治疗策略铺平道路，有利于防止某些由于治疗产生的促转移区域的发展。PAME细胞可能是未来潜在的治疗和转移预防靶点。
以上研究主要是基于实验方法探索转移起源，那么在我们生物信息学分析中，又该如何定义影响癌症患者转移的关键因素呢？下面小编还想和大家分享一个探究人类癌症转移的数据库：HCMDB。
肿瘤转移是癌症患者死亡的主要原因。在过去十年中，高通量技术已经提供与癌症转移相关转录组变化的全基因组概括。许多微阵列和RNA测序研究致力于寻找不同类型癌症的转移相关表达模式。然而，这些表达数据仅仅被分散存储在各个数据库中，缺乏一个集成的数据挖掘平台，并对这些数据进行高效地分析挖掘。为便于对转移相关转录组数据的深入分析，研究者对这些转移相关的表达数据进行全面整合，并构建出HCMDB(人类癌症转移数据库，http://hcmdb.i-sanger.com/index)，在这里我们可以免费查询跨平台转移的转录组数据。
图8. HCMDB数据库
HCMDB的大规模转录组数据主要来源于GEO、SRA、TCGA数据库。在当前版本的HCMDB中，包含来自超过455个实验的29种癌症类型。为注释这些潜在的转移相关基因，研究者从7000多篇发表的文献中收集2183个基因(1901个蛋白编码基因，24个lncRNA和203个miRNAs)，构建易于使用的癌转移相关基因查询和浏览界面。
表1. HCMDB的数据资源
该数据库提供搜索功能，可以提供相关基因基本信息，以及在转移样本中的表达变化：
图9.检索功能
图10.转移相关基因的表达分析
此外，研究者还可以对不同数据中在转移与非转移样本中差异表达基因等进行检索，并提供可视化结果。
图11.差异表达基因及其可视化结果
当然，本文提供数据集合以及实验支持基因转移相关数据集下载。
图12.数据下载
除转录组差异外，近期发表于CELL的一篇文章也对癌症转移的基因组特征进行探究，该工作主要基于整合大规模基因组和临床数据，确定不同肿瘤类型转移模式和基因组改变之间的关联，为研究转移扩散的生物学基础提供宝贵的资源，并强调染色体不稳定性在癌症进展中的复杂作用，在这里我们就不重点介绍了，感兴趣的小伙伴们一定要自己去看哦。
图13. 癌症转移的基因组特征
癌细胞固然极其“可恨”，但是它顽强的意志品质却值得我们每个人学习。希望我们都能像“癌细胞”一样顽强，哪怕是只有一线生机，也绝不放弃任何前进的希望。今天的分享到这里就结束啦，我们下次再见~
参考文献：
1.On the origin of metastases: Induction of pro-metastatic states after impending cell death via ER stress, reprogramming, and a cytokine storm
2. HCMDB: the human cancer metastasis database
3. Genomic characterization of metastatic patterns from prospective clinical sequencing of 25,000 patients
来源：生信人
转自：医学科研小坑
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