导读
本研究旨在研究帕金森病(PD)和健康对照受试者(HC)的血清代谢物、肠道菌群组成和临床变量之间的联系。本研究共有124名受试者参与了研究(63名PD患者和61名HC受试者)。我们发现139种代谢物特征在PD组和HC组之间具有显著的预测性，且未发现代谢物特征和PD内临床变量之间的关联。PD患者血清代谢物谱的改变，代谢物特征和肠道菌群之间的相关性分析结果表明一些细菌类群与PD患者的脂质和能量代谢改变有关。
论文ID
原名：Multiomics implicate gut microbiota in altered lipid and energy metabolism in Parkinson’s disease
译名：多组学表明肠道菌群与帕金森病患者的脂质和能量代谢改变有关
期刊：NPJ Parkinson's disease
IF：8.651
发表时间：2022.04
通讯作者：Pedro A. B. Pereira&Filip Scheperjans
通讯作者单位：芬兰赫尔辛基大学
实验设计
实验结果
1. 代谢组分析
我们通过血清样品代谢组学分析共鉴定了7585种代谢物特征。支持向量机(SVM)模型显示出GC-MS代谢谱具有81%的分类准确度，LC-MS的正离子和负离子模式电离数据分别有77%和72%的分类准确度(表1)。UHPLC-MS分析以正和负 ESI模式进行，流动相和梯度洗脱曲线如表5所示。
表1 混淆矩阵
这是基于(a) LC-MS的正离子模式数据、(b) LC-MS的负离子模式数据、(c) GC-MS数据的混淆矩阵。对于每个数据，混淆矩阵显示了通过重复采样测试的100个模型的平均值。我们将60%的数据作为训练集，40%作为测试集。平均正确分类率(CCR)代表每个数据。根据类别标签的排列顺序，LC-MS正离子模式CCR降至49%，LC-MS负离子模式CCR降至47%，GC-MS的CCR降至47%。
表5 流动相和梯度洗脱曲线
我们使用SVM递归特征消除(SVM-RFE)来进行健康对照(HC)和帕金森病(PD)受试者之间的预测性代谢物特征的选择，进而在特征分析实验中选择前10%的特征。在SVM模型中，通过SVM-RFE选择的对PD和HC样本分类贡献最大的代谢物特征被称为“关键预测”代谢物。我们总共选择了139个特征(即代谢物)：101个特征来自LC-MS数据，38个特征来自GC-MS数据(表2)。所有7585代谢物特征的通路富集分析揭示了20个受干扰的途径中肉碱穿梭、维生素E代谢、甘油磷脂、鞘脂、脂肪酸和氨酰基tRNA生物合成的显著变化(表3)。根据使用3级代谢物标准倡议(MSI)的人类代谢组数据库(HMDB v.4)和LipidMaps，我们将这些特征在5ppm的精确质量匹配基础上进行了假定注释。年龄、性别、身体质量指数(BMI)、饮食成分和PD相关的临床变量(如药物治疗)并未显示出对所选的139种代谢物特征有任何生物学意义上的影响证据，除了COMT抑制剂可能有非常轻微的影响外。在PD组中，在对运动症状发作后的时间、取样年龄和其他已知的临床协变量进行调整后，我们发现临床变量和所有7585代谢物特征之间没有建立关联。所有7585种代谢物特征均可用于PD分析，因为尽管它们缺乏对PD的预测潜力(这与所选的139种代谢物特征不同)，但其中一些仍可能仅与PD组中的临床变量相关。
表2 关键预测代谢物的特征
PD和HC组之间的关键预测代谢物特征，按效应大小的降序排列。这些前10%的代谢物特征是在对它们区分PD和HC的预测能力进行排序后选出的。在数据库搜索期间，被注释为“Unknown”的m/z特征没有准确的质量匹配或光谱匹配信息。这些物质的质谱图可以在补充文件中找到，X对应于表中的未知特征1、2、3和4。
表3 通路分析的结果
这是LC-MS和GC-MS数据的通路分析结果。代谢物重叠表示代谢物在总代谢物上重叠的数量。我们对在Mummichog算法内实施的多重比较调整p值，并将其作为累积分布函数(CDF)和表达式分析系统探索器(EASE)的惩罚步骤。
2. 代谢组-微生物组相关分析
为了便于对比，我们将PD组和HC组分别在属、科和门水平上对所选的139种代谢物特征和细菌分类单元进行了相关性分析。经过了所有结果表格的整理，我们获得了在MSI 3级鉴定水平上对代谢物峰值ID的最佳鉴定结果。所有已鉴定的分类单元/代谢物相关对(使用所选的139个代谢物特征和所有细菌丰度数据)的平均相关值在0.3或以上，且具有95%的“置信度”(详情见“方法”一节)。
我们通过肠道菌群属分类水平的内部PD分析确定了总共176个相关对，而内部HC分析则产生了202个相关对。可以看出，这两个组所代表的分类单元和代谢物有一些重叠，但总体上细菌分类单元-代谢物对关联存在实质性差异。为了帮助识别代谢物类别和细菌之间可能的联系，我们使用代谢物类别为属水平的内部PD和HC分析结果制作了网络图(图1和图2)。在肠道菌群的科分类水平上，内部PD分析确定了总共67对相关对，而内部HC分析确定了总共85对相关对。最后，我们通过肠道菌群门分类水平的内部PD分析确定了总共17个相关对，内部HC分析确定了总共6个相关对。
图1 内部PD关联网络
这是细菌属和代谢物类别之间的内部PD相关性网络。边的厚度表示相关性的强度。蓝色边表示正相关性，橙色边表示负相关性。绿色节点代表代谢物类别，可能包含一个以上的代谢物特征(这就是为什么两个节点之间可能有多条边)，而青色节点代表细菌属。
图2 内部HC关联网络
这是细菌属和代谢物类别之间的内部HC网络。边的厚度表示相关性的强度。蓝色边表示正相关性，橙色边表示负相关性。绿色节点代表代谢物类别，可能包含一个以上的代谢物特征(这就是为什么两个节点之间可能有多条边)，而青色节点代表细菌属。
为了进一步聚焦这项研究，我们将相关对削减到只包含那些细菌的分类单元，这些细菌分类单元(i)在目标分类水平上未被分类；(ii)在先前使用相同主题数据的研究中以及样本收集的两个时间段中的一个或两个时间点，这些细菌分类单元在PD和HC组之间存在差异；(iii) 这些细菌分类单元先前在PD微生物组文献中被系统地鉴定为PD组和HC组间差异丰富的分类单元(表4)。本文中使用的细菌丰度数据对应于Aho等人采集样本的第二个时间点。为了使关系可视化，我们生成了第三个内部PD网络图，使用属水平的数据和代谢物类别如前所述，但限于修剪后的相关对(图3)。
表4 选择的结果
这是基于先前在属、科和门水平上文献中报道的分类单元选择结果。在斜线(/)之前，我们报告了Aho等人使用与本研究相同的细菌数据获得的结果；斜线之后，我们报道了Boertien等人的结论。NA表示该研究中没有该分类单元的结果。
图3 选定的内部PD关联的网络
这是使用选定结果的细菌属和代谢物类别之间的内部PD相关性网络(表4)。边厚度表示相关性的强度。蓝色边表示正相关性，橙色边表示负相关性。绿色节点代表代谢物类别，而青色节点代表细菌分类单元。
在赫尔辛基队列中，我们发现之前报道了六个细菌属在HC组和PD组之间在一个或两个时间点上的差异性(在本文中选择的统计显著性α阈值从最初的0.1改为0.05)，即:双歧杆菌属、罗斯氏菌属、普雷沃菌属、布劳特氏菌属、乳杆菌属和梭菌属XIVa。所有这些除了梭菌属XIVa外，都在文献中有过相关报道，即它们在HC组和PD患者之间存在差异。在属水平分析中，我们还发现普雷沃菌属、双歧杆菌属、罗斯氏菌属和乳杆菌属与一种或多种代谢物特征相关(表4)。
除了Aho等人提到的细菌外，之前在PD微生物组文献中报道的其他差异丰富的细菌属也在我们的数据集中与代谢物特征共同变化，我们也使用该信息来汇集我们的研究结果。在属的水平上，阿克曼氏菌、双歧杆菌、普拉梭菌、普雷沃氏菌、乳杆菌和罗斯氏菌在文献中被多次报道，只有阿克曼氏菌和普拉梭菌没有在Aho等人的研究中被报道为差异丰富的菌属(表4)。
Aho等人研究发现，在一个或两个时间点上，PD组和HC组之间有七个细菌家族的丰度不同，即:双歧杆菌科、普雷沃氏菌科、Rikenellaceae、毛螺菌科、巴氏杆菌科、乳杆菌科和紫红球菌科。除紫红球菌科外，所有这些家族在文献中也有报道，它们在HC组和PD组患者之间存在差异。在我们的家族水平分析中，其中三个显示出与一种或多种代谢物特征的相关性(表4)。Boertien等人还报道了最常发现的差异丰富的细菌家族，即双歧杆菌科、普雷沃菌科、毛螺菌科、乳杆菌科、疣微菌科、大肠杆菌科等，在我们的同期研究中，我们在任何时间点都没有发现差异显著的后四个菌科(表4)。
在这项研究中，我们也在门的水平上分析了我们的数据，不同于Aho等人，我们发现了各种代谢物与黏胶球形菌纲、疣微菌门、Synergistetes和软壁菌门之间的相关性。在PD组和HC组中，我们反复发现某些门的丰度存在差异，如疣微菌门、厚壁菌门和拟杆菌门，尽管只有疣微菌门与代谢物特征相关(表4)。
讨论
使用mummichog方法，我们在本研究中发现PD患者血清代谢组的差异在20多种通路上具有功能意义，包括肉毒碱穿梭、维生素E代谢、甘油磷脂、鞘脂、脂肪酸和氨酰基tRNA生物合成。在另一项研究中，我们证明了PD患者皮脂中肉碱穿梭、鞘脂和脂肪酸途径的变化——这些都在本研究所检测血清的20条通路中。
鞘脂代谢相关通路的变化可能表明细胞信号转导和调节存在关键性的转变。鞘脂质的失调已知与α-突触核蛋白病、溶酶体代谢的改变以及PD中观察到的线粒体代谢有关。最近Alessenko和Albi的研究表明鞘脂与许多神经退行性疾病有很强的联系。除了血浆中鞘脂代谢的改变，PD代谢组学和脂质组学研究显示神经酰胺、鞘苷和鞘苷-1-磷酸的变化尤其明显。这并不令人惊讶，因为在这项研究中，最显著变化的通路之一与甘油磷脂代谢有关。甘油磷脂和鞘磷脂被认为是代谢疾病中脂肪毒性的“阴和阳”。代谢组中这些互补和对立力量的失调引起了许多代谢性疾病中的脂肪毒性。因此我们可以推测，这种脂肪毒性损伤可能是PD的潜在病理生理机制之一。
由于β-氧化不足导致的长链酰基肉碱减少已被证明具有早期诊断PD的潜力，特别是长链酰基肉碱。在最近研究肠道微生物组的工作中，Rosario等人证明了细菌叶酸和同型半胱氨酸代谢在PD中的作用。较高数量的细菌粘蛋白和宿主降解酶与PD发病有关。细菌叶酸代谢对人类代谢调节的作用尚不完全清楚。叶酸是维持甲基化反应的必需维生素B。肝脏通过翻译后修饰中的许多甲基化反应，调节激素、肌酸、肉碱和磷脂酰胆碱的合成。如果甲基化能力由于叶酸代谢的改变而受损，那么在我们的结果中观察到磷脂酰胆碱的合成也可能受损，同时肉碱转运就会被分流或中断。最近报道的一项代谢组学分析研究也观察到了肉碱代谢、脂肪酸和类固醇代谢的改变。几项研究报告了PD患者血浆中肉碱和酰基肉碱水平的降低；然而， Jiménez-Jiménez等人在PD受试者的血浆或脑脊液中没有观察到酰基肉碱水平的变化。因此，没有明确的证据可以表明肉碱表达的方向，但有许多研究证据表明，酰基肉碱的保护机制导致了其他脂肪酸的变化，从而干扰肉碱穿梭，最终导致PD中脂质的生成。研究人员已经证明，低密度脂蛋白和高密度脂蛋白等分子与皮脂和痤疮等相关疾病有直接联系，并证明脂质代谢是一种复杂的相互作用，影响肠道的脂质吸收、肝脏的生物合成和组织(包括皮肤)中的螯合。血清代谢组的这些结果可以证明肠道微生物组、血清代谢组和皮脂代谢组之间的联系。
长链脂肪酸β-氧化的促进作用可以高度调节能量代谢。此外，我们在来自没有PD的老年参与者血清中，观察到肉碱穿梭和维生素E的代谢失调。因此，血清代谢组中肉毒碱穿梭和维生素E以及脂肪酸的扰动可能表明PD期间能量代谢的显著变化。此外，维生素E作为预防PD的保护因子作用已经与维生素C一起被广泛研究，用于治疗早发性PD。本研究中基于通路分析的血清代谢组学显示了PD中能量代谢和脂质代谢的广泛变化。最近人们在其他生物流体(如皮脂和脑脊液)中报道了这些能量代谢和脂质代谢失调的危害，并进行了很好的总结。我们利用微生物组分析的知识来研究这些代谢变化是否是完全内源性的，还是部分是由PD患者肠道微生物组的变化引起的。
由于细菌分类水平和代谢物特征之间具有相关性，并且MSI Level 3是推断性的鉴定方式，因此我们将主要集中在代谢物类别的水平上进行以下讨论。如果文献中分类单元总是(或通常)在PD中被报告为过多或过少(详情参见表4的最后一栏)，我们将在括号内报告这些分类单元以及在本研究中检测到的相关性信号。
在本研究的所有细菌分类水平中，我们最常检测到的相关性代谢物特征是甘油磷脂类中的推定代谢物和脂质。我们的非调整结果和调整后的结果都是如此，调整后的结果仅关注以前文献中发现的在HC组和PD组间差异丰富的细菌分类单元(表4)。具体来说，在PD内分析和集中讨论调整后的结果时，我们发现各种甘油磷脂和罗斯氏菌(在PD中降低；正相关)、乳杆菌(在PD中增加；正相关)、阿克曼菌(在PD中增加；一个正相关，一个负相关)、双歧杆菌科(在PD中增加；正相关)、巴氏杆菌科(在PD中降低；正相关)、乳酸菌科(在PD中增加；正相关)、疣微菌科(PD增加；一个正相关，一个负相关)以及疣微菌门(在PD中增加；一个正相关，一个负相关)之间的相关性(表4)。阿克曼菌、疣微菌科和疣微菌门与两种代谢物特征具有相同的正相关和负相关，乳杆菌属和乳杆菌科具有相同的代谢特征。
除了罗斯氏菌和巴氏杆菌科，所有这些分类单元通常被发现在PD中过度表达，并且大多数与各种甘油磷脂呈正相关，在我们的分析中也发现这些甘油磷脂在PD中过度表达(表2)。在内部HC分析中的情况并非如此，在内部HC分析中，唯一检测到的与甘油磷脂相关的是乳杆菌科(与不同的代谢物呈正相关)和大肠杆菌科(也与不同的代谢物呈正相关)(表4)。PD和HC的属水平网络图(图1和2)也表明PD中细菌代谢动力学存在可能的改变。总的来说，这些结果表明这些细菌分类单元在PD中过量存在，这可能在很大程度上与PD中甘油磷脂丰度的增加有关。
所有这些甘油磷脂都有内源性(人类宿主)来源，并与细胞信号、脂质过氧化和脂质代谢有关。这些磷脂是所有已知生命系统中细胞膜的主要成分，并在各种生物过程中发挥作用，包括信号诱导和充当转运蛋白。人们发现有几个与甘油磷脂代谢直接或间接相关的遗传因素，如PLA2G6与PD风险相关(PLA2G6是早发性PARK14连锁肌张力障碍-帕金森综合征的病因)。α-突触核蛋白存在于PD患者大脑中路易体的聚集物中，直接与细胞脂质膜中带负电荷的磷脂结合，并优先与小脂质囊泡结合。α-突触核蛋白与脂质膜的结合也会导致其双层结构的改变，从而诱导这些脂质囊泡的形成。在PD中非常重要的是，脂质膜和α-突触核蛋白之间的这些相互作用会影响聚集率，并可能导致体外和体内膜完整性的破坏。可溶性α-突触核蛋白与双脂质层的结合会导致聚集体和小纤维的形成。二十二碳六烯酸(DHA)占质膜中甘油磷脂酯化脂肪酸的60%，暴露于DHA后，α-突触核蛋白逐渐组装成淀粉样纤维，其显著特征是DHA本身成为聚集物的一部分。值得注意的是，α-突触核蛋白基因表达随着DHA摄入的增加而增加，产生的寡聚体对细胞有毒性。α-突触核蛋白也与线粒体膜中的特定磷脂结合，调节线粒体能量产生的效率，各种线粒体磷脂似乎对α-突触核蛋白的毒性有影响。因此，α-突触核蛋白和各种磷脂之间的相互作用及其代谢可能在PD发病机制中起重要作用，肠道菌群可能与这些相互作用有关。
我们还在内部PD分析中发现了肠道菌群与其他脂质的相关性。罗斯氏菌(在PD中降低)与固醇类脂质呈负相关。罗斯氏菌还与脂肪酰基类代谢物呈正相关，这可能与饮食有关。乳杆菌(在PD中增加)与呋喃脂肪酸呈负相关，来源于饮食、人类和/或细菌的呋喃脂肪酸与细胞信号、脂质过氧化、脂质代谢和脂质转运代谢有关。在我们的血清数据(表2)中，所选的139种代谢物特征有一半的脂肪酰基类代谢物在PD中过度表达，但这与在Sinclair等人的PD皮脂数据相反。
在内部HC分析中，我们发现大肠杆菌科(在PD中增加)与内源性鞘脂呈正相关，鞘脂与膜稳定性、脂质过氧化和脂质代谢相关。在我们的研究中，这种代谢物特征在PD中略有减少(表2)，并且我们在内部PD分析中没有发现它与PD相关细菌分类单元之间的相关性。
虽然对这些关于脂质的结果的解释总体上并不像在甘油磷脂的情况下那样可以推断出一种特定的模式，但与对照组相比，我们发现检测到的大多数脂质在PD中过度表达(表2)。脂质代谢和PD之间这种联系的重要性不能被夸大：正如前面在磷脂的背景下提到的，最近的研究表明α-突触核蛋白优先与特定的脂质家族和分子结合，后者促进α-突触核蛋白与突触膜的相互作用，并影响α-突触核蛋白的寡聚化和聚集。这些相同的脂质-蛋白质复合物也通过干扰细胞质中的脂质酶和溶酶体中的脂肪酶的催化活性来影响脂质代谢。人们在脑和血浆中也报道了PD中的脂质组成变化，并发现促炎性脂质介质与氧化应激、炎症和进行性神经变性有关。PD中脂质和细菌之间的联系(如果有的话)可能包括细菌通过饮食对脂质摄入的调节及其对宿主体内这些脂质的生物利用度的不同影响。我们的研究结果通过建立HC组和PD组之间的细菌分类单元和血清中存在的脂质代谢物之间的联系，表明这种情况可能在PD的病理和发展中起作用。
我们还发现了其他类别的代谢物，特别是己糖类和羧酸或衍生物类。我们在双歧杆菌和双歧杆菌科中发现了己糖代谢物特征的两种相同负相关性(两种分类单元水平在PD中均增加；表4)，这两种相关性仅在内部HC分析中发现。我们认为该代谢物可能是内源性的，并参与糖代谢分流，将部分葡萄糖从主要的糖酵解途径转移到磷酸三糖和6-磷酸果糖的水平上。
最后在内部PD分析中，我们发现羧酸或衍生物类别中的代谢物特征与细菌家族丹毒丝菌科之间存在正相关，该细菌家族在以前的研究中大多在PD中过度存在。这种代谢物特征被初步鉴定为L-脯氨酸，可能是内源性的或来源于微生物组。我们初步认为预测PD的四种不同代谢物是L-脯氨酸(表2)，并且在所有情况下PD中L-脯氨酸的平均丰度都略有下降。L-脯氨酸可以作为甘氨酸和谷氨酸受体的激动剂，如NMDA和AMPA。谷氨酸和甘氨酸都是神经递质。虽然在我们的数据中并非如此，但之前有报道称L-脯氨酸在PD中出现过多，并且已知与蛋白质代谢和结构、细胞分化、胚胎生长和发育以及生态失调情况下的肠道微生物群落再平衡有关，已知L-脯氨酸膳食补充剂会影响肠道微生物组成和几种细菌代谢物的肠道浓度。当在PD研究中检测到普雷沃氏菌属和普雷沃氏菌科时，人们通常发现PD的发病率减少。在这项研究中，它与L-脯氨酸呈负相关，而脯氨酸在PD组中的水平略有不足。
总之，我们的研究旨在尽可能广泛地调查PD中细菌和代谢物丰度之间的关联。为此，我们采用了一种基于非靶向代谢组学的数据驱动方法。我们希望这些结果可以用于建立更有针对性的研究，要么是观察性的，要么是实验性的，以探索我们假定的发现。我们利用非靶向代谢组学，气相色谱和液相色谱法检测了约7500个血清代谢物特征。其中139例被认为对PD状态具有特别的预测作用。它们大多与脂质代谢有关，在PD中也多见。PD代谢差异与肉碱穿梭、维生素E代谢、甘油磷脂、鞘脂和脂肪酸有关，表明PD的改变与能量和脂质代谢有关。我们的研究结果表明，一些肠道细菌属(如普雷沃氏菌属、双歧杆菌属、阿克曼菌属、乳杆菌属、罗斯氏菌属)的丰度与这些代谢特征的丰度相关，因此也可能与PD的代谢变化有关。
与许多其他代谢组学临床研究一样，这项研究的一个局限性可能是药物使用引起的变异。我们分析了几种药物的代谢物特征之间的可能联系(如LEDD评分),没有发现药物作用的明确迹象。然而，如果没有靶向性的代谢组学研究，我们很难排除这种影响。我们的数据中可能有这些药物或它们的分解产物，但由于所有可能相关的药物代谢物的质量未知，我们无法具体地分析它们。我们希望像目前这样的非靶向代谢组学研究可以作为未来靶向代谢组学研究的基础，这些研究可以更好地处理潜在的变异来源，如药物或其代谢产物。
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