原创 洪翔宇 生物医学科研宝典 2022-05-08 18:44
铜是所有生物体必需的金属元素，在生命活动过程中发挥重要作用。正常生理状态下，铜离子维持着较低浓度并保持动态平衡，当铜离子异常蓄积则可引起铜毒性，进而诱发细胞死亡。然而，铜离子诱发细胞死亡的具体分子机制尚未阐明。
近日，美国Broad研究所PeterTsvetkov与ToddR. Golub研究团队在Science发表题为“Copper induces cell death by targeting lipoylated TCA cycle proteins”的论文，证实铜依赖性受控细胞死亡方式是一种不同于已知细胞死亡机制的新型细胞死亡方式，当阻断已知的细胞死亡方式时，铜离子仍然可以诱导细胞死亡，研究团队将这种细胞死亡方式命名为——Cuprotosis（铜死亡）。
研究发现，细胞内铜离子积累后，一方面，铜离子可与硫辛酰化蛋白结合促使其发生寡聚化并异常聚集，另一方面可降低Fe-S簇蛋白水平，二者共同导致蛋白质毒性应激反应，最终诱发细胞死亡即铜死亡。
摘要
铜是所有生物必不可少的辅助因子，但如果浓度超过由进化保守的体内平衡机制维持的阈值，它就会变成有毒的。然而，过量的铜是如何诱导细胞死亡的还不清楚。在这篇论文里，作者在人类细胞中展示了依赖铜的、受调节依赖于线粒体呼吸的细胞死亡与已知的死亡机制不同。研究表明，铜依赖死亡是通过铜与三羧酸（TCA）循环的脂化成分直接结合而发生的。这将导致脂化蛋白的聚集和铁硫簇蛋白的丢失，从而导致蛋白质毒性应激并最终导致细胞死亡。这些发现可以解释对铜稳态机制的需求。
重要结果
1. 铜离子载体诱导的细胞死亡是一种新型死亡方式——铜死亡
图1. 铜离子载体诱导的细胞死亡是非凋亡、非铁死亡和非坏死性凋亡
结合铜的多种结构不同的小分子在数百个细胞系中共享杀伤谱（图1A），为了进一步确定铜离子载体的细胞毒性是否依赖于铜本身，作者分析了强效铜离子载体伊利司莫（Elesclomol）的杀伤潜力。细胞培养基中铜的来源是血清，因此，在没有血清的情况下生长的细胞对Elesclomol具有抗性。相比之下，Elesclomol的敏感性通过以1:1的比例添加铜完全恢复。铜补充剂同样使细胞对六种结构不同的铜离子载体的治疗敏感（图1B），但补充其他金属，包括铁、钴、锌和镍，未能增强细胞死亡（图1B）。
那么铜离子载体介导的细胞死亡是否受到调节？特别是短期暴露是否会导致不可逆转的后续细胞毒性？用浓度低至40 nM的铜离子载体Elesclomol脉冲处理仅2小时导致细胞内铜水平增加15至60倍，超过24小时后引发细胞死亡（图1C）。该结果表明铜介导的细胞死亡确实受到调节。
既往报道表明Elesclomol诱导ROS依赖性凋亡细胞死亡，但Elesclomol诱导的细胞死亡不涉及caspase3的切割或激活（图1D&E)。同样，当细胞凋亡的关键效应子BAX和BAK1被敲除（图1F）或当细胞在泛半胱天冬酶抑制剂（Z-VAD-FMK和Boc-D-FMK）处理下（图1G），Elesclomol仍能诱导细胞死亡，再次表明铜诱导的细胞死亡与细胞凋亡不同。此外，用其他已知细胞死亡机制的抑制剂治疗——包括铁死亡（ferrostatin-1）、坏死性凋亡（necrostatin-1）和氧化应激（N-乙酰半胱氨酸），都未能消除铜离子载体诱导的细胞死亡（图1G），表明铜诱导的细胞死亡存在与已知细胞死亡途径不同的机制（图1H）。
2. 线粒体呼吸调节铜离子载体诱导的细胞死亡
图2. 线粒体呼吸调节铜离子载体诱导的细胞死亡
关于铜死亡的具体机制有一个线索是作者们发现依赖于线粒体呼吸的细胞对铜离子载体的敏感程度是糖酵解细胞的1000倍左右（图2A)。与对诱导铁死亡的GPX4抑制剂ML162的敏感性相比，用线粒体抗氧化剂、脂肪酸和线粒体功能抑制剂处理对铜离子载体的敏感性具有非常明显的影响（图2B）。此外，在电子传递链（ETC）的复合物I和II的抑制剂以及线粒体丙酮酸摄取抑制剂中，细胞死亡减弱，对铁死亡没有影响（图2B）。重要的是，线粒体解偶联剂FCCP对铜毒性没有影响，这表明铜诱导的细胞死亡需要线粒体呼吸，而不是三磷酸腺苷（ATP）的产生（图2C）。
同样，在缺氧条件（1% O2）下生长的细胞减弱了铜离子载体诱导的细胞死亡，而在常氧条件（21% O2）下用HIF脯氨酰羟化酶抑制剂FG-4592强制稳定缺氧诱导因子（HIF）途径则没有（图2D），进一步强调了细胞呼吸在介导铜诱导的细胞死亡中的作用。
然而，用铜离子载体处理并没有显著降低基础呼吸或与ATP相关的呼吸，但确实显著降低了呼吸的备用能力（图2E），这表明铜不直接针对ETC而是TCA循环的组成部分，这些结果建立了铜离子载体诱导的细胞死亡和线粒体代谢之间的联系，而不是ETC（图2F）。
3. FDX1与三羧酸循环相关代谢物参与调控铜死亡
图3. FDX1和硫辛酸基因是铜离子载体诱导的细胞死亡的关键介质
为了最大限度地提高筛选的普遍性，作者专注于两种结构不同的铜离子载体（Elesclomol和双硫仑的活性形式DDC）的交叉点（图3A-C）。为了确定铜死亡的特定代谢途径，作者们进行了全基因组CRISPR-Cas9功能缺失筛选，从而确定铜死亡相关基因（图3A），从这一筛选中作者们找到了七个正调控基因以及三个负调控基因，其中FDX1和蛋白质硫辛酰化（Protein lipoylation）是铜离子载体诱导细胞死亡的关键调控因子。
通过敲除7个基因（图3A蓝色标记）挽救了这两种化合物的杀伤作用，包括FDX1（编码一种还原酶，已知可将Cu2+还原为其更具毒性的形式Cu1+，并且是Elesclomol的直接靶标）和六个编码硫辛酸途径的任一组分（LIPT1、LIAS、DLD）或脂酰化（PDH复合物，包括DLAT、PDHA1和PDHB）的基因（图3D）。这些观察结果通过一个独立的基因敲除筛选来验证（图3E）。此外，代谢酶筛选显示，复合物I的基因抑制也使细胞免于铜诱导的死亡（图3E）。个别基因敲除研究进一步证实，FDX1和LIAS的缺失赋予了对铜诱导的细胞死亡的抵抗力（图3F&G），进一步加强了FDX1和铜诱导的细胞死亡之间的功能联系。
4. FDX1是蛋白质脂酰化的上游调节因子
图4. FDX1是蛋白质脂酰化的上游调节因子
值得注意的是，FDX1和硫辛酸途径的组分在它们整个细胞系组中的活力效应高度相关（图4A）。其次，对208个人类肿瘤标本进行了硫辛酸染色和FDX1免疫组织化学实验，发现FDX1和脂酰化蛋白的表达高度相关（图4B&4C以及图6A-D）。第三，使用硫辛酸特异性抗体作为DLAT和DLST脂酰化的量度来确定FDX1敲除是否影响蛋白质脂酰化。FDX1敲除导致蛋白质脂酰化完全丧失（图4D），并且还导致细胞呼吸显著下降，与LIAS敲除相似（图4E）。
此外，FDX1缺失后的代谢物分析导致丙酮酸和α-酮戊二酸的积累和琥珀酸的消耗，由于PDH和α-酮戊二酸脱氢酶的TCA循环受到抑制，蛋白质脂酰化受到损害（图4F）。
5. 铜直接结合并诱导脂酰化DLAT的寡聚化
图5. 铜直接结合并诱导脂酰化 DLAT 的寡聚化
为了验证铜毒性和蛋白质脂酰化之间的联系这一假设，从细胞裂解物中纯化了DLAT和DLST，发现这些蛋白质与带铜的树脂结合，但不与钴或镍树脂结合（图5A）。当敲除FDX1消除蛋白质脂酰化时（图4），DLAT和DLST不再与铜结合（图5B），表明硫酰部分是铜结合所必需的。
有趣的是，作者发现铜与脂酰化TCA循环蛋白的结合导致DLAT的脂酰化依赖性寡聚化（图5B&5C）。类似地，Elesclomol敏感细胞的处理增加了DLAT寡聚体和可溶性DLAT的水平，而Elesclomol不敏感细胞系或FDX1敲除（FDX1KO）细胞的处理仅在高得多的浓度下导致DLAT寡聚化（图5D&E)。用强还原剂TCEP处理并煮沸消除了DLAT的低聚形式，表明寡聚体是二硫键依赖性的。通过免疫荧光证实了这些发现，观察到通过短脉冲Elesclomol处理对DLAT病灶的显著诱导，其中这种病灶在脂酰化缺陷的FDX1敲除细胞中减少（图5F-H）。
6. 铜诱导的死亡机制与铜稳态失调的遗传模型相同
图6. 化学和遗传诱导的铜依赖性细胞死亡的共同机制
为了探索与铜离子载体治疗相关的铜毒性机制是否与这些自然发生的铜稳态紊乱相同，研究者检查了三个实验模型。首先，在人胚胎肾 (HEK)293T 和ABC1细胞中过表达SLC31A1，这显著增加了对生理铜浓度的敏感性。重要的是，在过表达SLC31A1 的细胞中，铁死亡、坏死性凋亡和凋亡抑制剂并不能阻止铜诱导的细胞死亡，而铜螯合剂、FDX1 KO和 LIASKO 均能部分挽救铜诱导的细胞死亡。此外，天然细胞内铜伴侣谷胱甘肽的消耗导致铜依赖性细胞死亡。最后，研究者使用了威尔逊氏病的小鼠模型，其中Atp7b缺失导致细胞内铜积累和细胞随着动物年龄的增加而死亡。将老年Atp7b缺陷(Atp7b-/-)小鼠的肝脏与Atp7b杂合子(Atp7b-/+) 和野生型对照小鼠的肝脏进行比较，观察到脂酰化和Fe-S簇蛋白的丢失，以及Hsp70（是分子伴侣和折叠催化剂的细胞网络的核心组成部分）丰度增加。这些在铜毒性小鼠模型中的发现，表明铜过载导致的细胞效应与铜离子载体诱导的细胞效应相同。总之，这些数据表明过量的铜促进脂酰化蛋白质的聚集和Fe-S簇蛋白的不稳定，导致蛋白质毒性应激并最终导致细胞死亡。
结论
促进铜诱导的细胞死亡的机制示意图
1. 本研究揭示了一种新的细胞死亡机制——铜死亡，证明铜诱导的细胞死亡是由一种古老的机制介导的：蛋白质脂酰化。
2. 铜死亡是通过铜与TCA循环的脂酰化成分直接结合而发生的，这导致脂酰化蛋白质聚集，以及铁硫簇蛋白质丢失，从而导致蛋白质毒性应激并最终导致细胞死亡。
3. FDX1是蛋白质脂酰化的上游调节因子，FDX1和蛋白质脂酰化是铜死亡的关键调节因子。
展望
这项研究针对大量肿瘤细胞系，利用多种铜离子载体诱导铜死亡及探索其潜在分子机制，提示铜离子载体杀伤特定肿瘤细胞（高表达FDX1与硫辛酰化蛋白）有可能成为肿瘤治疗新方向，具有重要的临床指导意义。
值得一提的是，这项研究发现FDX1可调控蛋白硫辛酰化修饰，然而，是否存在上游分子调控FDX1？是否存在其他分子与信号通路参与调控铜死亡？此外，是否存在其他金属离子诱导的细胞死亡方式？由此衍生的更多科学问题值得我们进一步深思与探索。
原文链接：http://doi.org/10.1126/science.abf0529
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