近几年 COVID-19 全球大流行，目前研究重点和热点主要集中在流行的病毒变异株，针对病毒学和免疫学的相关研究可以为接下来可能出现的变异株特异性和广谱性的疫苗研发提供研究依据。SARS-CoV-2 病毒的致病机制为病毒表面刺突蛋白识别人体细胞表面 ACE2 并入侵完成感染（如图 1），而中和抗体通过阻断这一过程来实现抗病毒效果，所以一直以来不同研究均关注疫苗程序接种完成后不同人群的体液免疫反应，例如中和抗体滴度及对人体的保护作用。
随着研究的进行，研究者们发现 T 细胞免疫在人体对抗 SARS-CoV-2 病毒过程中也发挥重要作用，如美国加州拉霍亚免疫研究所（LJI）就观察到了 SARS-CoV-2 感染后的 T 细胞反应，并对其进行了深入的研究。
图 1：SARS-CoV-2 病毒侵入和中和抗体机制。中和抗体通过与病毒刺突蛋白部分结合从而阻断病毒进入宿主细胞。当病毒侵入被阻断后，感染就被阻止了。刺突蛋白亚基 S1 包含了受体结合结构域 RBD，该区域可以结合宿主细胞的受体 ACE2。RBD 的突变可能会导致 SARS-CoV-2 变体更具传染性并增加传播性或降低疫苗的有效性。ACE2，血管紧张素转换酶 2。
新冠肺炎患者体内具有针对新冠病毒的T细胞，且可识别不同突变体
美国加州拉霍亚免疫研究所（LJI）从 2020 年开始连续发表数篇研究均聚焦 SARS-CoV-2 的 T 细胞研究。2020 年的时候该研究所就发表了一篇 IF 41.6 的高分文章[1]，该文章基于对恢复期 COVID-19 患者外周血细胞的多个测试结果，研究团队在 70% 的受试者中检测到了病毒特异性 CD8+ T 杀伤细胞且 100% 受试人群检测到病毒特异性的CD4+ T 细胞。之后病毒不断出现变异，而这些突变通常发生在刺突蛋白，从而影响抗体对其的结合能力和中和功能，使病毒能够从人体的免疫系统逃逸。
但是，新研发的疫苗多为靶向刺突蛋白，在病毒突变后，疫苗激发的中和抗体的滴度和活性均受到了影响。于是拉霍亚免疫研究所随即对 2020 年感染了 SARS-CoV-2 且课题组展开研究期间已经处于恢复期的病人的外周血样本再次进行了研究[2]：用 SARS-CoV-2 变异毒株的刺突蛋白的肽库孵育外周血后，进行活化标记物 AIM 流式检测。数据表明，刺突蛋白活化的 T 细胞反应与突变体毒株无关，不同毒株的突变并未影响 T 细胞反应。这些证据都证明了T细胞反应在 SARS-CoV-2 研究中的重要性。
图 2：COVID-19 恢复期的个体对于 SARS-CoV-2 参考毒株和变异毒株的刺突蛋白的 T 细胞反应。A）Bio-Rad ZE5 流式细胞仪上进行刺突蛋白特异的 CD4+ 和 CD8+ 进行AIM检测的圈门策略；B-E）展示此次研究中 28 个个体的各种测试总览：不同毒株 CD4+AIM+ T 细胞百分比、不同毒株 CD8+AIM+ T 细胞百分比、不同毒株 IFN-γ ELISPOT 结果、不同毒株 IL-5 ELISPOT 结果；F-G 应用和 B-C 一样的测试，但是对于 AIM 实验时的肽库进行了滴度的摸索。
四种 COVID-19 疫苗都可使人体产生针对不同 SARS-CoV-2 突变株的 T 细胞
虽然 2021 年 SARS-CoV-2 疫苗在全球进行了推广普及，但病毒仍然在变异和逃逸，尤其是 Omicron 仍旧引发了全球的疫情。拉霍亚免疫研究所在证明了 T 细胞的重要性之后，延续了之前的研究思路，对于多种疫苗接种后诱导的 T 细胞反应是否可以交叉识别不同 SARS-CoV-2 变异毒株。在疫苗接种 6 个月后，对受试者体内记忆 T 细胞进一步进行了广泛和深入的研究，并于 2022 年发表了第二篇 IF 41.58 的高分文章[3]。
与之前用 Bio-Rad 流式细胞仪 ZE5 进行表面活化标记物检测 AIM 不同的是，这次在进行多种疫苗诱导的 T 细胞反应研究中，该课题组进行了检测方法的改变：表面活化标记物检测 AIM 和胞内细胞因子 ICS 联合检测（见图 3）。
图 3：Bio-Rad ZE5 流式细胞仪上建立 AIM 表明活化标记物和 ICS 胞内细胞因子染色联合方法的圈门策略、方法确认。A）标明了流式检测的圈门策略：如何排除粘连细胞、如何进行特异 CD4+ 细胞的表面活化标记物和胞内因子、如何进行特异 CD8+ 细胞的表面活化标记物和胞内因子。B-C）为了确保检测结果的准确性和可重复性，三种方法进行了方法的确认和验证确保表面活化标记物和胞内细胞因子染色联合检测和单独检测结果的一致性。
在确认了 AIM 联合 ICS 方法的准确性之后，课题组对于四种不同疫苗在不同免疫程序下的不同时间点对于免疫受试者进行了跨人群追踪。结果表明（见图 4），接种 6 个月后，受试者体内至少 83% 的 CD4+ T 细胞反应和 85% 的 CD8+ T 细胞反应保持不变，而 Omicron 特异的 RBD 记忆 B 细胞识别率降低到了 42%。这篇文章进一步揭示了大多数的T细胞反应的功能被保存以抵抗病毒变异，这点可能对 SARS-CoV-2 多种突变株特异性的二级防御发挥着重要的作用。
图 4：疫苗程序完成后的 5～6 个月的个体，体内的记忆 T 细胞和 B 细胞对于 Omicron 和其他突变株的反应。Omicron 和其他突变株在这些个体内的记忆 B 细胞对于 A）刺突蛋白和 B）受体结构域 RBD 的反应；Omicron 和其他突变株在这些个体内的 C）AIM+CD4+ T 细胞、D）细胞因子 +CD4+、E）AIM+CD8+ T 细胞和 F) 细胞因子 +CD8+ T 细胞，其中细胞因子 + 是基于 IFN-γ、IL-2、TNF-α 和颗粒酶的总和。
基于 T 细胞的检测可以区分 SARS-CoV-2 感染和疫苗接种
目前针对 SARS-CoV-2 的免疫诊断，仍缺乏可以区分预存免疫、疫苗接种诱发的免疫或者病毒感染后免疫的手段。如果能够有效区分 T 细胞是疫苗激活或感染激活，对于纵向进行疫苗的研究、疫苗的加强策略和理解 COVID-19 具有深远的影响。在这种情况下，该课题同期另发一篇 IF 21 的高分文章[4]，主要研究比较四种不同测试人群 T 细胞反应的差异：第一类没有感染且没有接种疫苗 I-V-、第二类感染但没有接种疫苗 I+V-、第三类没有感染但接种过疫苗 I-V+ 和第四类感染且接种过疫苗 I+V+。结果表明（见图 5），在所有恢复期患者和疫苗接种个体中均可以检测到 SARS-CoV-2 特异的 CD4+ T 细胞反应，而未感染或未接种人群 50% 可以检测到特异反应。
同时未感染组（I-V-）的反应水平显著低于其他组群的反应，感染恢复且接种过疫苗的群体（I+V+）反应比恢复期（I+V-）或者疫苗组反应（I-V+）要高。更重要的是 CD4RE 肽库下的反应可以区别恢复期个体（I+V-，I+V+）和未感染个体（I-V+）。这篇文章建立了基于 T 细胞的免疫诊断方案，根据受试者的疫苗接种和自然感染史对受试者进行分类，具有成为纵向监测疫苗接种和建立 SARS-CoV-2 保护相关性重要工具的前景。
图 5：研究人群：没有感染且没有接种疫苗 I-V-、感染但没有接种疫苗 I+V-、没有感染但接种过疫苗 I-V+、感染且接种过疫苗 I+V+。Bio-Rad ZE5 流式细胞仪跨人群检测 SARS-CoV-2 特异的 AIM+CD4+ T 细胞反应，用百分比表示。个体外周血细胞用不同肽库刺激后进行检测，Spike 肽库指刺突蛋白多肽构成的肽库， CD4RE 指除了刺突蛋白的其他蛋白组多肽构成的肽库， EVB 肽库是对照组。
使用高通量多参数流式分析仪 ZE5 对 SARS-CoV-2 病毒和 COVID-19 疾病的免疫反应进行免疫表型研究
对于冠状病毒感染的多种免疫反应进行跨人群表征研究，需要进行全面的免疫表型分析。其中无症状到症状严重的个体之间的免疫表型差异会很大，人群免疫反应的差异规律对疫苗开发具有指导性的意义。荧光标记的抗体结合流式细胞术是对患者样本进行免疫表型分析的无与伦比的技术。使用 ZE5 细胞分析仪可以快速、准确分析病毒和疫苗诱导的免疫反应。
● 多参数免疫表型；
● 快速发现中和抗体；
● 检测促炎细胞因子和细胞因子受体；
● 内置 96/384/深孔板/流式管自动进样器可以快速检测大量样本；
● 液路系统内置、系统集成度高、仪器不停机即可进行鞘液和废液的更换；
● 仪器性能和信号稳定，确保不同时间点检测的数据可基于同个基线进行追踪比较。
转自：丁香学术
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