线粒体，作为一种双层膜半自主细胞器，它是细胞中制造能量的结构，是细胞有氧呼吸和利用氧化磷酸化产生 ATP 的场所的主要场所。其“大佬”地位毋庸置疑，但它的功能状态与线粒体膜电位、线粒体膜通道、线粒体 Ca2+ 浓度、呼吸复合体活性、活性氧生成以及 DNA 突变密切相关。线粒体质量控制通过蛋白质平衡、线粒体自噬、动力学和生物发生等方式的协调来维持线粒体的完整性和功能。
我们之前已经给大家介绍过线粒体动力学，线粒体损伤相关的机制和研究方法了，今天我们就来讲讲线粒体相关的热点里中标国自然最多的一个——线粒体自噬。
线粒体自噬对于维持线粒体和细胞稳态至关重要。在活性氧（ROS）、营养缺乏、细胞老化等作用下，细胞内的线粒体会出现去极化损伤。为了维持线粒体网络的稳定性并保持细胞内环境的稳定性，细胞使用自噬机制选择性地包裹和降解细胞内受损或功能失调的线粒体。
线粒体自噬主要有以下 4 个关键步骤:
1) 受损线粒体去极化，失去膜电位。
2) 线粒体被自体包裹形成线粒体自噬体。
3) 线粒体自体与溶酶体融合。
4) 线粒体内容物被溶酶体降解。溶酶体或液泡酸性水解酶流入自噬体降解受损线粒体。
线粒体自噬的关键步骤
自线粒体自噬概念提出以来，其机制研究受到广泛关注。目前研究中发现的机制通常可分为两类：泛素（Ub）依赖性通路和Ub非依赖性通路。
Ub依赖性通路
泛素依赖途径的关键蛋白是PINK1和Parkin，因此也被称为PINK1–Parkin介导的线粒体自噬途径（PINK1–Parkin mediated mitophagy）。PINK1是一种位于去极化线粒体上的丝氨酸/苏氨酸激酶，而Parkin是一种E3泛素连接酶，可催化泛素转移到线粒体底物。
当线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential,MMP,Am) 受损时，PINK1 进入线粒体内膜的途径受阻导致 PINK1 在线粒体外膜的胞质面上稳定聚集。同时，这会募集并激活 Parkin，Parkin 蛋白酶的空间构象发生改变，转化为活化的 E3 泛素连接酶，然后泛素化线粒体上的蛋白质。PINK1 与Parkin 相互作用，共同调控线粒体自噬过程以维持线粒体质量 。
此外，除了 PINK1-Parkin 通路之外，还有非 Parkin 依赖性的泛素依赖性通路。也就是说，PINK1还可以通过泛素磷酸化直接招募自受体蛋白(如 NIX、BNIP3 和 FUNDC1)到线粒体，受体蛋白募集 LC3，这使得自噬体能够吞噬线粒体。
非泛素依赖途径
非泛素依赖的线粒体自噬是由线粒体自噬受体（Mitophagy Receptors）来主导，这与泛素依赖途径之间存在明显差异。
泛素依赖途径线粒体自噬的一个核心机制是磷酸化泛素的产生；而线粒体自噬受体如NIX、BNIP3和FUNDC1等都包含一个保守的LC3结合域（LC3-interaction region，LIR），他们可以通过LIR基序直接与自噬相关蛋白（ATGs，如LC3）结合，启动自噬。
在哺乳动物中，这些受体主要包括 Nip3 样蛋白 X (Nip3-like protein X,NIX) 受体bcl2 相互作用蛋白 3 (BCL2-interacting protein 3,BNIP3) 受体、FUN14 结构域包含 1(FUN14 domain containing 1,FUNDC1) 受体。
下面我们来看一下线粒体自噬在疾病中的作用：
神经退行性疾病
在神经元中，当受损的线粒体不能被线粒体自噬完全清除时，就会产生活性氧、氮氧化物和其他氧化性物质。这些氧化性物质可引起多种神经退行性疾病，如阿尔茨海默病（AD）、帕金森病（PD）、肌萎缩侧索硬化症（ALS）、亨廷顿舞蹈症（HD）等。尽管这些疾病的病变部位和病因各不相同，但神经元变性是它们的共同点。
肌萎缩侧索硬化症是一种致命且无法治愈的疾病，其特征是运动神经元选择性变性，导致进行性肌肉无力和呼吸衰竭导致死亡。据报道，受损线粒体聚集可能在ALS的疾病进展中起作用。目前已发现的一些ALS相关基因（如OPTN）与线粒体自噬有功能联系，特别是去除蛋白质聚集体或受损的线粒体。
多功能激酶TBK1在线粒体自噬中起重要作用。TBK1有近66种不同的突变与ALS和额颞叶痴呆有关，这些突变也与线粒体自噬受体OPTN有关。总的来说，自噬受体 OPTN 及其激酶 TBK3 是受损线粒体自噬体吞噬选择性所必需的。
心血管疾病
高血压是一种常见且多发的全身性疾病，增强线粒体自噬有助于降低血压并保护心血管系统。编码Parkin的PARK2基因可能是血压升高的遗传原因，另外有研究表明，虾青素可以通过增加PINK1、Parkin、mtDNA等的表达来促进线粒体自噬和生物合成，从而减少高血压引起的血管重塑。
动脉粥样硬化的存在和进展受氧化低密度脂蛋白 （ox-LDL） 的显著影响，而线粒体自噬水平与 ox-LDL 高度相关。有证据表明，ox-LDL 诱导的人血管平滑肌细胞 （VSMC） 凋亡通过激活线粒体自噬而减少。
线粒体自噬经常在心力衰竭的初始阶段被阻断。如果适当提高线粒体自噬程度，可以延缓心力衰竭的进展。相反，线粒体自噬在心力衰竭晚期经常被过度激活，导致心肌细胞功能障碍和心力衰竭加重。线粒体自噬障碍会显著增加ROS水平并破坏mtDNA，导致心肌细胞钙超负荷、炎症损伤、坏死、细胞凋亡和心肌纤维化，所有这些都会促进心力衰竭的发生。
肿瘤
线粒体自噬通过去除功能失调的线粒体来抑制肿瘤生长;否则，异常的线粒体可能会改变细胞并促进肿瘤的发展。还有研究表明，Warburg效应、线粒体自噬受损和巨噬细胞M2更容易极化都是由胃癌中PINK1缺失引起的。Parkin会影响磷酸酶和张力蛋白同源物（PTEN）介导的糖酵解代谢控制。
研究表明，Parkin缺乏会促进PTEN降解，进而导致PI3K/AKT信号在癌细胞中被激活。癌细胞发生代谢重塑，由于PI3K/AKT信号传导而促进糖酵解。线粒体自噬的受体BNIP3水平的升高与黑色素瘤患者的生存率低有关，而B3-F16黑色素瘤细胞中BNIP10的消耗会损害体内肿瘤的生长。
代谢性疾病
代谢性疾病是由代谢问题引起的疾病，包括代谢紊乱。Parkin介导的线粒体自噬可以维持胰岛分泌，避免1型糖尿病（T1D）的发生。2型糖尿病（T2D）的症状包括高血糖和胰岛素抵抗（IR），这些都与线粒体损伤有关，可能是因为高血糖水平会促进线粒体产生ROS和导致组织损伤的氧化应激。几种线粒体自噬相关蛋白（包括NIX、PINK1和Parkin）在轻度高血糖的早期糖尿病患者中表达增加，但在T2D患者中表达降低。
下面给大家分享一下线粒体自噬相关蛋白的检测方法：
与其他自噬类似，线粒体自噬在正常稳态情况下，发生水平较低，相关靶点比较难检测。因此我们需要使用一些化合物来刺激样本，促进线粒体自噬的发生，进而检测相关蛋白。以PINK1和BNIP3为例：
1）PINK1
PINK1由581aa组成，分子量约为63kDa。前面也讲到在稳态条件下线粒体上的PINK1会被切割水解，根据切割位点不同，会产生~52kDa或~48kDa截短形式。因此在正常生理条件下，PINK1全长形式存在较少。
PINK1蛋白的结构及剪接机制
在自噬诱导条件（CCCP处理）下，PINK1不能易位到线粒体内膜，阻断了蛋白切割过程。PINK1与线粒体外膜复合物（TOM）相互作用并稳定在线粒体外膜上。FL-PINK1在线粒体膜上积累，在WB实验中可看到条带增强。
PINK1蛋白的WB检测
注：CCCP是一种强效的线粒体氧化磷酸化解偶联剂，促使线粒体内膜对H+产生通透性，导致线粒体内膜两侧的膜电位丧失，诱导线粒体自噬。
2）BNIP3L/NIX和BNIP3
BNIP3L首先被发现为一种促凋亡的BCL2家族蛋白，可诱导细胞凋亡或坏死；不过最近的研究发现，BNIP3L可通过自噬促进网织红细胞的线粒体消除。
BNIP3与BNIP3L/NIX具有60%的同源性，基本结构和功能相似；在缺氧条件下BNIP3L/NIX和BNIP3会被转录激活，通常以同源二聚体的形式锚定在线粒体外膜，促发线粒体自噬。使用Cobalt Chloride模拟低氧也可以达到此作用。
BNIP3的免疫荧光检测
参考文献
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