PBJ | 叶绿体基因工程高效表达微生物活性酶为超细纤维污染的消除和纺织染料靛蓝的降解提供经济有效的方法

纺织工业排放的微纤维(直径< 5毫米)和纺织染料无处不在，不仅对环境造成巨大的污染，同时也危害着水生动植物和人类的生命。因此，使用酶来降解超细纤维污染和纺织染料的脱除是必不可少的环节。然而用于降解和脱除的传统微生物酶在规模和清理大规模污染的负担能力方面面临重大挑战。

近日，Henry Daniell团队在国际知名期刊Plant Biotechnology Journal发表了题为“Abatement of Microfiber Pollution and Detoxification of Textile Dye–Indigo by engineered plant enzymes”的文章，该研究通过叶绿体基因工程，在跨质体烟草植物中表达了微纤维和靛蓝染料生物降解所需的酶，为微纤维污染的消除和纺织染料的降提供了一种新的、且经济有效的方法。

首先，他们对米曲霉漆酶基因AoLac和木质素过氧化物酶基因PcLiP构建了两个烟草叶绿体转化载体（pLD）。并且在收获转基因材料后证实了这两个基因特异性整合到烟草叶绿体基因组中的位点。pLD载体包括16S-trnI和trnA 侧翼序列，用于同源重组到叶绿体基因组的倒置重复区，进行位点特异性整合。另外，他们进一步通过Southern blot分析确认了表达盒在叶绿体和同质体中的位置特异性稳定整合。

图2. 漆酶和木质素过氧化物酶基因的叶绿体转化载体、位点转化整合和母系遗传

图3. 用southern blot分析评价跨质体Cp-漆酶(AoLac)和Cp-LiP (PcLiP)植物的同源性

接着，他们检测了通过烟草叶绿体转化体系合成的漆酶和木质素过氧化物酶活性。结果发现Cp-Lac和Cp-LiP酶蛋白活性均表现出随收获天数变化的稳定增长，其中，Cp-Lac (126天)和Cp-LiP(98天)的高活性样品被用于进一步研究靛蓝染料降解和超细纤维降解。

图4.酶活性的测定

随后，他们评价了Cp-Lac和Cp-Lip这两种生物合成酶对靛蓝染料的降解效率。以5.0 mg/ml的剂量，在反应混合物中使用100 mg/L靛蓝染料浓度反应1小时后，Cp-Lac对靛蓝染料的降解率为86%、 Cp-LiP的降解率为63%、WT对靛蓝染料的降解率为2%。此外，发现Cp-Lac和Cp-LiP对靛蓝染料的降解表现出线性剂量依赖性(图5c),而且Cp-LiP具有较高的氧化还原电位，Cp-Lac对靛蓝染料的脱色效果更好。

图5. 用叶绿体表达的漆酶和木质素过氧化物酶降解靛蓝染料的研究

然后，他们比较了Cp-Lac和商用漆酶制剂对牛仔布料纤维的靛蓝染料降解效率。用Cp-Lac和商用漆酶制剂(LMS 200)在室温下对牛仔纤维释放的靛蓝染料反应1h后发现，Cp-Lac对靛蓝染料的降解能力较商用漆酶提高24%。

图6. 植物或商业微生物漆酶降解牛仔超细纤维靛蓝染料的评价

棉纤维与其他纤维素基质相比，其结晶度指数较高，这使其难以进行酶解，因此，对棉花纤维进行预处理是降低其纤维素结晶度的重要步骤。该团队对棉花的预处理方法进行了优化，以提高棉花对酶的敏感性，他们最后采用含7% NaOH和12%尿素的碱预处理方法，在-20℃条件下处理4小时，进一步研究了棉绒微纤维的酶解。

图7. 棉纤维水解预处理优化

最后，他们使用多种酶的混合物对碱预处理的棉纤维和牛仔纤维降解后葡萄糖的释放效率进行评估。结果表明，在不同叶绿体转化系统合成的酶的协同作用下，葡萄糖释放效率最高可达88%。另外发现，在酶混合物中添加Cp-酶(在跨质体植物中表达的酶)可以使昂贵的商业纤维素酶混合物的剂量减少8倍。

图8.用微生物和植物酶的混合物对棉绒微纤维进行酶解

该研究报告了通过使用Cp-酶的新方法使干燥皮棉微纤维在增值产品和靛蓝染料脱毒方面的可行性。该团队也表明，对于未来的商业应用，Cp酶将与工业合作伙伴进行评估。

原文链接：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/pbi.13942

转自：“植物生物技术Pbj”微信公众号

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