NAR | 上海大学李根喜/张娟开发腙介导的CRISPR/Cas12a系统以提高系统特异性、快速激活系统

Cas12a (CRISPR-associated protein 12a) 是来自 V-A 型成簇规则间隔回文重复序列 (clustered regularly interspaced palindromic repeats, CRISPR) 系统的核酸内切酶，用于通过使用其专用 RNase 功能域处理来自阵列的 CRISPR RNA (crRNA) 进行基因组编辑。它可以通过识别其靶位点在激活内在核酸酶活性后不加选择地切割单链 DNA (single-stranded DNA, ssDNA)，目前已用于核酸检测。

然而，这种系统不适合区分非常相似的 ssDNA 序列。此外，相似的 ssDNA 序列之间的干扰可能会在单个反应系统中发生交叉反应，从而影响分析的灵敏度和特异性。此外，通常也很难找到与 Cas12a 蛋白匹配的原型间隔区相邻基序 (protospacer adjacent motif, PAM) 序列来直接检测短靶序列。

2022年9月26日，上海大学李根喜及张娟共同通讯在Nucleic Acids Research（IF=19）杂志在线发表题为“Hydrazone chemistry-mediated CRISPR/Cas12a system for bacterial analysis”的研究论文。该研究首次提出并构建了利用化合物腙介导CRISPR/Cas12a系统。在该系统中，腙被设计并用于通过利用互补碱基配对引起的邻近效应来加速整个激活链的形成，从而快速有效地激活 CRISPR/Cas12a 系统。此外，腙的引入可以提高 CRISPR/Cas12a 系统的特异性，使其能够有效区分单碱基错配。因此，腙的引入将拓宽 CRISPR/Cas12a 系统的应用。

腙是有机化合物的一类，是羰基与肼缩合而成的化合物。腙具有反应快速、反应条件温和、选择性好等优点。由于 CRISPR/Cas 系统的可编程性依赖于指导 RNA 和核酸的相互作用，因此研究人员设想可以将腙引入系统的起始序列中，以更灵活地激活 CRISPR/Cas12a 系统，这不仅可以提高特异性，还可广泛用于不同目标的分析。

铜绿假单胞菌是一种常见的环境细菌，可通过动物粪便、食物和水迅速传播。该细菌可引起感染性疾病，如中耳炎、肺炎、角膜炎、败血症和心内膜炎。这种细菌的传统检测方法包括菌落培养和计数，这对于微生物检测来说是常规、准确和可靠的。然而，这些方法需要大量人力且耗时长，这极大地限制了它们的应用。因此，迫切需要开发一种新的检测铜绿假单胞菌的方法。

在这项研究中，研究人员构建了一个基于腙介导的 CRISPR/Cas12a 系统的检测平台。在该系统中，活化链被巧妙地设计为一个发夹结构，它被精心分成两个片段，分别由两个腙连接基团、肼和一个醛基修饰。同时，由于靶序列与探针的特异性结合，释放了肼基修饰的分裂片段，从而形成了整个活化链，并激活了腙介导的CRISPR /Cas12a 系统。因此，腙的引入不仅提高了CRISPR/Cas12a系统的特异性，而且加速了CRISPR/Cas12a系统的激活过程。

腙介导的CRISPR/Cas12a系统（图源自Nucleic Acids Research ）

研究人员进一步利用建立的系统应用于分析铜绿假单胞菌中，通过特异性识别16S rDNA中具有特征片段的探针链释放肼基修饰的活化链。该方法显示出从 3.8 × 102 菌落形成单位 (colony-forming units, CFU)/ml 到 3.8 × 106 CFU/ml 的宽线性范围，最低检测限为 24 CFU/ml。

基于腙介导的CRISPR/Cas12a系统的分析细菌的原理（图源自Nucleic Acids Research ）

总之，该研究构建了一个腙介导的 CRISPR/Cas12a 系统，并探索了其区分单碱基错配的能力。利用互补碱基配对产生的邻近效应，可以加速腙键的形成。鉴于其模块化和独特的结构特性，普遍和通用的化合物腙可以将分裂的活化链连接到整个活化链，从而有效地激活CRISPR/Cas12a系统。

在该系统的基础上，进一步开发了高灵敏度的检测平台并应用于细菌检测，该方法在未来可能具有巨大的应用潜力。此外，该平台不仅可以用于细菌中16S rDNA的检测，还可以借助适体或基于探针的识别级联反应直接检测核酸靶点。同时，该平台还可以为其他非核酸靶点的间接检测提供稳定且具有成本效益的检测系统。因此，腙的引入很大程度拓宽CRISPR/Cas12a系统的应用范围。

原文链接：

https://doi.org/10.1093/nar/gkac809

转自：“iNature”微信公众号

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